Морфологические изменения кожи вызванные эмульсионным фотосенсибилизатором на основе фуранокумаринов борщевика Сосновского

Shlyapkina VI, Kulikov OA, Balashov VP, Ageev VP, Pleshkova KI, Nuyanzina VA, Khutorskaya IA, Averkina MO. Morphological changes of the skin caused by a photosensitizer emulsion based on furanocoumarins of Sosnovsky's Hogweed’s. Morfologicheskie Vedomosti – Morphological newsletter. 2023;31(2):757. (2).757

Введение. Гигантские борщевики чрезвычайно токсичны, так как вызывают буллезный фотодерматит одинаковый с ожогами 2-й степени, что при большой площади поражения может приводить к интоксикации и летальному исходу [1]. В России наибольшую опасность представляет борщевик Сосновского (Heracleum Sosnovsky), так как он широко распространен и содержит высокие концентрации фуранокумаринов [2-3]. Исследователи проводят дифференциацию между системными фототоксическими реакциями кожи, обусловленными цитотоксическими свойствами фуранокумаринов под воздействием длинноволнового ультрафиолетового света и контактным аллергическим фотодерматитом [4]. При этом сравнения всей микроскопической картины в случае контакта с растениями, обладающими фотосенсибилизирующими свойствами в литературе не проводится. Имеются достаточно давние и редкие исследования кожных и системных токсических эффектов фуранокумаринов [5]. Однако, в настоящее время отсутствуют данные о системном фотосенсибилизирующем действии фуранокумаринов борщевика Сосновско-го и других гигантских борщевиков. Отсутствует удобная и легко дозируемая форма фуранокумаринов ввиду того, что фуранокумарины являются довольно липофильными веществами и легко образуют нерастворимые в воде игольчатые кристаллы [6-7]. Для оценки фототоксичности необходимо также решить проблему растворимости фуранокумаринов в воде. Это можно сделать путем создания эмульсионной формы [8]. Получение лекарственной формы фуранокумаринов может привести к изменению или исчезновению нативного фотосенсибилизирующего эффекта, вызываемого самим растением [9]. До настоящего времени не разрабатывались и не использовались эмульсии фуранокумаринов на основе лекарственного растительного сырья борщевиков. В связи с этим становиться актуальным контроль специфической активности действующих веществ, в нашем случае фуранокумаринов. Эффективная лекарственная форма фуранокумаринов при доступном виде сырья для ее изготовления может широко использоваться как средство для PUVA-терапии (терапии путем употребления фотосенсибилизирующих средств, например, псоралена, с последующим облучением всего тела ультрафиолетовым светом) или как противоопухолевое средство в борьбе с кожными неоплазиями.

Цель исследования: оценить фотосенсибилизирующее действие новой эмульсионной формы фуранокумаринов борщевика Сосновского путем исследования морфологических изменений кожи у лабораторных крыс.

Материалы и методы исследования. Комплекс фуранокумаринов извлекали из сока надземной части растения борщевик Сосновского (далее - БС) и подвергали качественному и количественному анализу согласно описанному методу [10]. Для изготовления эмульсии сухую фракцию фуранокумаринов сока БС растворяли при нагревании в персиковом масле (Мирролла, Россия) достигая концентрации 8-метоксипсоралена (далее 8-МОП) в растворе 6,125 мг/мл. При данной концентрации масляный раствор мог оставаться стабильным при температуре 20°С продолжительное время. При изготовлении эмульсии фуранокумаринов в качестве стабилизатора использовали водный 2,5% раствор полисорбата 80 (Твин-80, Sigma-Aldrich, США). При интенсивном перемешивании и постоянной температуре 25°С к 5 мл раствора полисорбата по каплям добавляли 1 мл (0,916 г) масляного раствора фуранокумаринов БС. Готовую смесь перемешивали в течение 10 минут, затем подвергали воздействию ультразвука (50 вт) 3 раза по 10 минут. Качество образовавшейся эмульсии контролировали по отсутствию игольчатых кристаллов с помощью световой микроскопии.

Для установления фотосенсибилизирующего действия эмульсионных фуранокумаринов были использованы белые беспородные крысы, молодые самцы массой 180–200 г. Животных разделили на 2 группы, опытную и контрольную по 5 особей в каждой. У животных была удалена шерсть на участке спины ближе к хвосту с помощью крема для депиляции за 24 часа до эксперимента. Крысам опытной группы внутривенно вводили эмульсию

Рис. 1. Участок кожи крыс, подвергнутый ультрафиолетовому облучению длиной волны 365 нм и мощностью 44 дж/см². Обозначения: А – участок кожи крысы до введения эмульсии с фуранокумаринами, выделенными из БС и до ультрафиолетового облучения; Б – участок кожи крысы спустя 7 дней после внутривенного введения эмульсии и последующего локального ультрафиолетового облучения; В – участок кожи крысы контрольной группы до введения физиологического раствора и до ультрафиолетового облучения; Г – спустя 7 дней после внутривенного введения физиологического раствора и последующего локального ультрафиолетового облучения

фуранокумаринов БС с концентрацией 8-МОП 1 мг/мл. Доза 8-МОП для животных составила 3 мг/кг что соответствовало допустимому объему внутривенного введения крысе [11]. В контрольной группе животным внутривенно ввели равный по объему физиологический раствор. Спустя

10 и 60 минут после внутривенного введения всем животным производили ультрафиолетовое облучение участка кожи площадью 4 см2, лишенного шерсти. Использовали источник ультрафиолетового излучения 365 нм, мощностью 40 вт (Camelion LH26-FS/BLB/E27, Китай).

Рис. 2. Микрофото гистологических препаратов кожи крыс опытной (А-Б) и контрольной (В-Г) групп спустя 7 дней после внутривенного введения эмульсии фуранокумаринов БС и ультрафиолетового облучения . Окр.: гематоксилином и эозином. Ув. А, В - х100; Б, Г - х400. Обозначения - на рис. А: 1 – ткань дермы с редуцированными клетками волосяных фолликулов, 2 – отслоенный эпидермис, 3 – лейкоцитарные клетки под базальным слоем эпидермиса; на рис. Б: 1 – деструктивно измененные клетки эпидермиса в слое фибрина, остатки зернистого слоя с более базофильной окраской, 2 – скопление гранулоцитов под базальным слоем эпидермиса; на рис. В: 1 – дерма, 2 – волосяные фолликулы и сальные железы, 3 – эпидермис; на рис. Г: 1 – нормальные клетки эпидермиса, 2 – сосочковый слой дермы, 3 – роговой слой эпидермиса

Интенсивность излучения измеряли с помощью радиометра ThorLabs PM100D (GmbH, Germany). Доза облучения для каждого животного составила 44 дж/см2. За животными наблюдали 7 дней и фиксировали макроскопические изме- нения состояния кожи в месте облучения. На 7-й день у животных под наркозом Зо-летил (Virbac, Франция) и Рометар (Bioveta, Чехия) забирался участок кожи площадью около 1 см2 в зоне, подвергнутой облучению.

Рис. 3. Микрофото гистологических препаратов кожи крыс за пределами распространения ожогового струпа спустя 7 дней после внутривенного введения эмульсии фуранокумаринов БС и ультрафиолетового облучения . Окр. гематоксилином и эозином. Ув.: А – х100; Б – х400. Обозначения - на рис. А: 1 – кожа в области повреждения, 2 – кожа вне зоны повреждения, 3 – волосяная луковица нормального волосяного фолликула; на рис. Б: 1 – клетки эпителиального влагалища волосяного фолликул, 2 – клетки сальной железы, 3 – клетки дермы

Рис. 4. Микрофото гистологических препаратов кожи крыс на периферии ожогового струпа спустя 7 дней после внутривенного введения эмульсии фуранокумаринов БС и ультрафиолетового облучения . Окраска гематоксилином и эозином. Ув.: А – х100; Б – х400. Обозначения - на рис. А: 1 – отслоение поврежденного эпидермиса от дермы, 2 – деструкция волосяного фолликула; на рис. Б: 1 – апоптоз клеток эпителиального влагалища, 2 – клетки волосяной луковицы с кариопикнозом, 3 - нормальные клетки дермы

Рис. 5. Микрофото гистологических препаратов кожи крыс на периферии ожогового струпа спустя 7 дней после внутривенного введения эмульсии фуранокумаринов БС и ультрафиолетового облучения . Окраска гематоксилином и эозином. Ув.: А – х100; Б – х400. Обозначения - на рис. А: – 1 – эпидермис, отслоившийся от дермы, 2 – нормальные клетки дермы; на рис. Б: 1 – сосочковый слой дермы, 2 – базальный слой эпидермиса, 3 – буллезное субэпидермальное расширение

Кожный дефект в месте биопсии ушивался и обрабатывался антисептиком. Для гистологического исследования образец кожи фиксировали в растворе 10% формалина. Препараты заливали в парафин и изготавливали срезы толщиной 10–15 мкм на роторном микротоме PFM Rotary 3003. Депарафинированные срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Гистологические препараты просматривали в световом микроскопе Nikon Eclipse NI-SS. Микрофотографии изготавливали с помощью фотокамеры Nikon DS-F21 при увеличении х100, х200 и х400.

Результаты исследования и обсуждение. Непосредственно после внутривенного введения эмульсии и спустя 7 дней все животные в экспериментальной группе выжили. Изменения в поведении крыс на протяжении всего периода наблюдения не отмечалось. На 7-е сутки у всех крыс опытной группы сформировался кожный струп, при этом в контрольной группе участок кожи, подвергнутый облучению, остался чистым и начал обрастать шерстью (рис. 1). Микроскопически у животных опытной группы в зоне струпа выявлено повреждение кожи однотипное с ожогом второй степени [12]. На рисунке 2-а, 2-б можно наблюдать отслоение эпидермиса у крыс опытной группы. Эпидермис представлен деструктивно измененными клетками в массе фибрина под слоем которого находится обширное скопление лейкоцитарных элементов (преимущественно гранулоцитов). Дерма утрачивает сосочковый слой из-за атрофии волосяных фолликулов. Вероятно, первичным в патогенетической картине повреждения является нарушение процессов регенерации в зернистом слое эпидермиса и исчезновение (выпрямление) сосочкового слоя дермы [13]. На рисунке 3 можно видеть волосяные фолликулы и клетки сальной железы участка кожи крысы опытной группы за пределами зоны воздействия ультрафиолетового излучения. Здесь четко различимы слои эпидермиса, отсутствуют скопления лейкоцитов. Клетки эпителиального влагалища и волосяной луковицы имеют четкие контуры, компактное ядро и хроматин.

На рисунке 4 представлен участок кожи в зоне расположения струпа. На нем можно наблюдать нечеткие контуры фолликулов, сгруппированные клетки волося- ной луковицы с нечеткими контурами ядра и рыхло расположенным хроматином. Клетки эпителиального влагалища волоса не различимы. По-видимому, клетки волосяного фолликула и придаточных тканей подверглись апоптозу, что могло быть следствием, как фотохимической деструкции ДНК, так и последующих иммунных реакций [14], при этом большему повреждению подвергнуты активные митотические клетки фолликула эпителиального происхождения. На рисунке 5 видна микроскопическая картина спавшихся субэпидермальных пузырей. На нем отмечается региональное отслоение эпидермиса от подлежащей соединительной ткани и сохранность сосочкового слоя дермы. Вероятно, причиной такого повреждения и отслоения эпидермиса является фотосенсибилизирующий эффект. Учитывая проникающую способность ультрафиолетового излучения с длиной волны около 365 нм, повреждения кожи сосредоточены исключительно на участках до сосочкового слоя дермы [15-16].

При изучении гистологической картины кожи крыс, подвергнутых системной фотосенсибилизации с помощью внутривенного введения эмульсионной формы фуранокумаринов БС, установлено, что в основе морфологических изменений кожи лежит нарушение дермальноэпидермального соединения и апоптотиче-ская гибель клеток волосяных фолликулов при сохранении нормальной морфологии дермы. Повреждение кожи не распространяется на более глубокие слои, по-видимому, вследствие лимитирования проникающего действия ультрафиолетового излучения с длиной волны 365 нм [15-16]. Не исключено также, что важным компо-