Морфологические изменения нейронов гранулярного слоя зубчатой извилины при стресс-индуцированной депрессии и возможность фармакологической коррекции новым производным глутаминовой кислоты

Депрессия относится к наиболее распространенным психическим заболеваниям, характеризуется высокой частотой рецидивов и низким уровнем ответа на лечение антидепрессантами [8]. Одной из основных причин депрессии является хронический стресс. Однако молекулярные механизмы, лежащие в основе патофизиологии депрессии до конца не изучены. Согласно нейрогенной гипотезе, депрессия связана с нарушением процесса нейрогенеза в зубчатой извилине гиппокампа [15]. Исследования на животных показывают, что нейрогенез у взрослых играет роль в обучении и памяти [7], регуляции гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой (ГГН) оси в ответ на стресс [15] и терапевтических эффектах антидепрессантов [13]. Нарушение регуляции ГГН оси при хроническом стрессовом воздействии приводит к чрезмерному выделению глюкокортикоидных гормонов, которые негативно влияют на процесс нейрогенеза, подавляя пролиферацию, дифференцировку и выживание клеток [16]. Нейроны зубчатой извилины особенно чувствительны к патогенным эффектам глюкокортикоидов, поскольку экспрессируют как высокоаффинные минералокортикоидные (МР), так и низкоаффинные глю- кокортикоидные рецепторы (ГР) [15]. ГР были также идентифицированы в делящихся клетках-предшественниках субгранулярной зоны зубчатой извилины [8]. Помимо прямого влияния на нейрональные клетки-предшественники, стресс может также играть косвенную роль в регуляции нейрогенеза в зубчатой извилине путем увеличения уровня внутриклеточного эндогенного супрессора P27KIP1, который ингибирует пролиферацию клеток [9]. Большое значение в регуляции нейрогенеза и нейропластичности отводится нейротрофическиму фактору мозга (BDNF), так как повышение глюкокортикоидов приводит к снижению его уровня в гиппокаме [4]. Кроме того, при стрессе происходит сверхактивация рецептора N-метил-D-аспарагиновой кислоты в зрелых гранулярных нейронах зубчатой извилины с последующим эксайтотоксиче-ским действием глутамата [8]. Таким образом, исследование морфологических изменений в зубчатой извилине может способствовать формированию новых терапевтических мишений в лечении депрессии.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Заключалась в морфометрическом исследовании изменений в гранулярном слое зубчатой извилины крыс в возрасте 12 месяцев при моделировании депрессии и оценке возможности фармакологической коррекции выявленных изменений β-фенильным производным глутаминовой кислоты – нейроглутамом (соединение под лабораторным шифром РГПУ-135).

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование выполнено на 30 нелинейных крысах-самцах в возрасте 12 месяцев, 10 из которых составили контрольную группу, 10 – группу с экспериментальной депрессией и 10 – группу животных с экспериментальной депрессией, получавших соединение с лабораторным шифром РГПУ-135. Исследуемое соединение вводили внутрибрюшинно за 1 час до моделирования депрессивного состояния в дозе 26 мг/кг. 1-я и 2-я группы животных получали соответственно массе эквивалентный объем физиологического раствора. При содержании животных, моделировании депрессивного состояния и выведения их из эксперимента руководствовались Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных, Хельсинской декларации (1975 г., 2000 г.). Экспериментальное моделирование депрессии у животных вызывали путем мягкого стрессового воздействия в течение 7 дней (ежедневно по 30 минут). Действие стрессоров, таких как виб- рация, громкий звук и пульсирующий яркий свет, осуществлялось в специальной камере, содержащей 6 изолированных отсеков и было непредсказуемым для животных. Данная модель приводит к развитию у животных стойкого депрессивного состояния и имеет сходство с клинической картиной депрессии [4]. Эвтаназию животных проводили с использованием «Гильотины для крыс» (AE0702, производитель «Open Science»). Головной мозг фиксировали в нейтральном забуференном 10%-м формалине. Парафиновые срезы изготавливали во фронтальной плоскости, окрашивали гематоксилином и эозином, тионином по методу Ниссля и изучали на уровне от –2,40 до –3,96 мм относительно брегмы [10] с использованием микроскопа «Axio Lab. A1» (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Германия). Фотодокументирование осуществляли камерой «AxioCam 105 color» (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Германия). С помощью модуля Image Analysis программы ZEN 1.1.2.0 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Германия) в гранулярном слое зубчатой извилины определяли следующие морфометрические параметры: площади ядер, цитоплазмы и перикарионов нейронов, ядерно-цитоплазматическое отношение (ЯЦО), относительные площади ядер, цитоплазмы и перикарионов нейронов, относительную площадь нейропиля.

Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Statistica 8.0 (StatSoft, USA). Обобщенные данные представляли в виде медианы (Me) с указанием интерквартильного интервала (Q1-Q3), где Q1 – 25 процентиль, Q3 – 75 процентиль. Различия между группами оценивали по критерию Краскела – Уоллиса с последующим множественным сравнением групп между собой с использованием критерия Дана и считали статистически значимыми при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

У животных всех экспериментальных групп слои зубчатой извилины четко определялись топографически и соответствовали цитоархитек-тоническим особенностям, описанным в литературе для крыс [14]. Гранулярный слой зубчатой извилины у контрольной группы животных был образован плотно расположенными близкими к округлой форме перикарионами нейронов, встречались единичные нейроны с гиперхрома-тозом цитоплазмы и сморщиванием (рис., А). Абсолютные и относительные морфометрические показатели нейронов представлены в таблице. При воздействии комбинированного стресса выявлены как качественные изменения нейронов гранулярного слоя зубчатой извилины крыс, описанные нами ранее [3], так и количественные. Качественные признаки повреждения были представлены участками очаговых выпа- дений нейронов, явлениями хроматолиза, полиморфными изменениями ядер: отмечалось как набухание, так и пикноморфные изменения (рис., Б).

Рис. Морфологические изменения в гранулярном слое зубчатой извилины крыс при стресс-индуцированной депрессии:

А – 1 группа, контроль; Б – 2 группа, депрессия; В – 3 группа, депрессия + нейроглутам. Окраска тионином по методу Ниссля. Ув. ×400

Наличие повреждений в гранулярном слое зубчатой извилины подтверждалось изменениями морфометрических параметров нейронов. Оценка абсолютных показателей у крыс с экспериментальной депрессией продемонстрировала достоверное уменьшение (р < 0,05) на 30,1 % площади ядер, на 13,9 % площади цитоплазмы и на 21,3 % площади перикарионов нейронов, а также снижение ЯЦО на 11,1 % (р < 0,05) по сравнению с контрольной группой (см. табл.).

Достоверные различия обнаруживались в снижении относительных площадей ядер на 34,4 % (р < 0,05), цитоплазмы на 17,9 % (р < 0,05), перикарионов нейронов на 23,9 % (р < 0,05) и увеличении относительной площади нейропиля на 27,5 % (р < 0,05) в гранулярном слое зубчатой извилины у животных 12 месяцев, подвергнутых воздействию комбинированного стресса по сравнению с контролем (см. табл.).

При фармакологической коррекции экспериментальной депрессии у крыс нейроглутамом в гранулярном слое зубчатой извилины наблюдалась гистологическая картина близкая к контрольной группе животных. Большинство нейронов характеризовалось ядрами и перикарионами близкими к округлым по форме (рис., В), хотя встречались сморщенные нейроны и нейроны с гиперхромией цитоплазмы, удельное количество последних снижалось [3], по сравнению со стрессированными животными без фармакологической коррекции.

Применение нейроглутама продемонстрировало достоверное повышение только абсолютных морфометрических показателей нейронов гранулярного слоя зубчатой извилины крыс по сравнению с животными без лечения: увели- чение площадей ядра на 16,4 % (р < 0,05), цито-     нейронов на 21 % (р < 0,05), ЯЦО снижалось на плазмы на 20,7 % (р < 0,05), перикарионов     12,5 % (р < 0,05) (см. табл.).

Изменение морфометрических параметров нейронов гранулярного слоя зубчатой извилины крыс, Ме (Q1–Q3)

Различия достоверны при p < 0,05: * по сравнению с животными группы Контроль, # по сравнению с животными группы Депрессия (критерий Краскела – Уоллиса с посттестом Дана).

В ходе проведенного нами морфометрического исследования установлено, что при мягком стрессовом воздействии, которое вызывает у животных депрессивные симптомы, отмечаются атрофические изменения нейронов гранулярного слоя зубчатой извилины, которые сочетаются с обратимыми и необратимыми процессами [3]. Данные изменения могут приводить к уменьшению объёма гранулярного слоя, что было продемонстрировано в исследованиях на грызунах, подвергшихся хроническому стрессу [11, 12].

Важно отметить, что в моделях депрессии у грызунов лечение антидепрессантами индуцирует увеличение снижения объема гранулярного слоя зубчатой извилины [6, 11]. Нами было показано, что при фармакологической коррекции экспериментальной депрессии у крыс нейроглутам способствовал уменьшению атрофических изменений в нейронах, что подтверждает его антидепрессантное и нейропро-текторное действия, выявленные ранее [1, 2].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что при моделировании стресс-индуцированной депрессии у крыс в возрасте 12 месяцев в гранулярном слое зубчатой извилины отмечаются атрофические изменения нейронов, которые характеризуются снижением абсолютных и относительных морфометрических показателей, таких как площади ядра, цитоплазмы, перикарионов нейронов, ядерно-цитоплазматическое отношение, а также повышение относительной площади нейропиля. Применение β-фенильного производного глутаминовой кислоты – нейруглатама (РГПУ-135) оказывает корректирующее нейропротек-торное воздействие, поскольку способствует снижению атрофических изменений нейронов, вследствие увеличения абсолютных морфометрических параметров, по сравнению с животными с экспериментальной депрессией.

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и Администрации Волгоградской области в рамках научного проекта № 19-415-340004\19.