Морфологические изменения в печени лабораторных животных при пролонгированном введении золотых наночастиц

цы (ЗНЧ), в том числе для доставки лекарственных веществ, генетического материала, антигенов, для решения задач диагностики и одновременно терапии опухолей [1, 2].

Одновременно с началом широкого применения ЗНЧ в биомедицинских целях возникли вопросы об их возможной токсичности. В настоящее время в экспериментах in vivo большинство опубликованных результатов было получено при внутривенном введении ЗНЧ, в то время как токсические свойства частиц при внутрибрюшинном, респираторном и пероральном введении изучены недостаточно. Данный факт, скорее всего, объясняется поиском путей эффективной доставки конъюгатов ЗНЧ к клеткам-ми- шеням при внутривенном введении. В ранее опубликованных нами статьях, посвященных изучению токсичности металлического золота, отмечено, что введение ЗНЧ сопровождается развитием воспалительной реакции, дистрофическими и некротическими процессами, накоплением частиц в макрофагах и ретикулярных клетках лимфатических узлов, а также активацией клеточного и гуморального иммунитетов [3–5].

Учитывая данные о возможной токсичности ЗНЧ, используемых в терапии злокачественных новообразований, целью проводимого нами исследования стала оценка выраженности и обратимости морфологических изменений в печени лабораторных животных при длительном пероральном введении золотых наночастиц разного размера.

Материал и методы. Исследование проведено на кафедре патологической анатомии и базе научнообразовательного центра фундаментальной медицины и нанотехнологий ГБОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В. И. Разумовского» Минздрава России. Эксперимент выполнен на 240 здоровых белых беспородных половозрелых крысах-самцах массой 180–220 г. При разработке модели экспериментального исследования за основу положено «Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» [6], а также методические указания МУ 1.2.2869–11 «Порядок оценки токсического действия наноматериалов на лабораторных животных».

В эксперименте использовали ЗНЧ, синтезированные в лаборатории нанобиотехнологии ИБФРМ РАН (г. Саратов): частицы коллоидного золота диаметром 2±1, 15±3 и 50±10 нм с числовой концентрацией 1014, 1.3*1012 шт/мл и 3.5*1010 шт/мл соответственно (концентрация золота 57 мкг/мл). Средний размер ЗНЧ определяли по электронно-микроскопическим изображениям на микроскопе Libra-120 (Carl Zeiss, Jena, Germany). Наночастицы коллоидного золота с размером 15 и 50 нм синтезировали цитратным методом Фрэнса путем восстановления золотохлористоводородной кислоты (HAuCl4, Sigma-Aldrich, USA) цитратом натрия. Наиболее мелкие частицы 2 нм получали по специальным методикам [7]. Для увеличения биодоступности и биосовместимости наночастицы были конъюгированы с полиэтиленгликолем PEG-SH (Nektar, USA).

Учитывая возможность длительного перорального применения ЗНЧ и препаратов на их основе, разделили эксперимент на 2 серии, в каждой серии по 9 опытных групп. Первая серия включала изучение морфологических изменений в печени лабораторных животных при пероральном введении ЗНЧ размерами 2, 15 и 50 нм продолжительностью 8, 16 и 30 дней. Вторая серия была посвящена анализу обратимости выявленных изменений, забор необходимого материала проводили через 14 дней после окончания введения ЗНЧ размерами 2, 15 и 50 нм в течение 8, 16 и 30 дней. К каждой опытной группе животных были сформированы контрольные группы, животным которых вводился физиологический раствор в объеме 1 мл в течение 8, 16 и 30 дней.

Для морфологического исследования образцы внутренних органов фиксировали в 10%-м растворе формалина, подвергали стандартной спиртовой и ацетоновой проводке, заливали в парафин. После депарафинизации срезы толщиной 5–7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином для обзорного гистологического изучения.

При морфологическом исследовании с использованием полуколичественных показателей применяли следующие критерии выраженности признака: «-» — признак отсутствует (0%); «+» — слабо выраженный признак (<30%); «++» — умеренно выраженный признак (30-60%); «+++» — сильно выраженный признак (>60%).

Морфометрический анализ гистологических препаратов проводили в 10 полях зрения с использованием системы анализа цифровых изображений микровизора медицинского μVizo-101 ЛОМО. Применяли также стандартный метод подсчета клеточных элементов при увеличении 200, 400 с использованием специализированной морфометрической сетки [8, 9].

Для выявления конгломератов ЗНЧ применяли метод микроскопии темного поля с использованием микроскопа Leica DM 2500 со специальной приставкой для темнопольной микроскопии при 400-кратном увеличении.

Для оценки размерозависимого воздействия ЗНЧ на морфологию печени использовали следующие морфометрические показатели: коэффициент нормализации паренхимы (КНП), количество непаренхиматозных элементов (НПЭ) в состав которых входили лимфоциты, клетки Купфера и клетки Ито и число двуядерных гепатоцитов [10]. КНП является одним из важнейших критериев в морфологической оценке состояния печени, поскольку он позволяет оценить интенсивность дистрофических и некробиотических изменений в печени на основе отношения количества нормальных гепатоцитов к гепатоцитам в состоянии дистрофии и некроза [11, 12].

Для изучения пролиферативной активности гепатоцитов проводили иммуногистохимическое исследование с использованием кроличьих поликлональных антител (Anti-Ki67, Abcam, United Kingdom). Выполняли одноэтапный протокол с трипсинизаци-ей — демаскировкой антигена по стандартной схеме проведения иммуногистохимического исследования [10]. Клетки, давшие положительную иммуногистохимическую реакцию, окрашивались в коричневый цвет. Результат реакции оценивали по системе подсчета Histochemical score. Система подсчета включает в себя интенсивность иммуногистохимической окраски по 3-балльной шкале и долю (%) окрашенных клеток и представляет собой сумму произведений процентов, отражающих долю клеток с различной интенсивностью окраски, на балл, соответствующий интенсивности реакции. Интенсивность окраски: 0 — нет окрашивания; 1 — слабое окрашивание; 2 — умеренное окрашивание; 3– сильное.

Формула подсчета:

Histochemical score = ∑ P (i) × i, где, i — интенсивность окрашивания, выраженная в баллах от 0 до 3; P (i) — процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью.

Для обработки полученных в ходе исследований данных использован пакет прикладных статистических программ Statistica 10.0 (StatSoftInc, США). Предварительная статистическая обработка данных заключалась в проверке соответствия формы распределения количественных признаков нормальному, для чего применяли тест Колмогорова — Смирнова, а также определяли равенство генеральных дисперсий с помощью F-критерия Фишера. Нулевую гипотезу отвергали в случае р<0,05. Для каждого показателя в исследуемых группах вычисляли среднее арифметическое (М), ошибку среднего арифметического (m). Оценку различий между выборками про-

Таблица 1

Изменения гистологического строения печени с учетом длительности введения ЗНЧ размером 2 нм

Исследуемые показатели, M±m (в 30 полях зрения)	Контрольная группа	Длительность введения ЗНЧ размером 2 нм
		8 дней		16 дней		30 дней
		В конце введения	Через 14 дней	В конце введения	Через 14 дней	В конце введения	Через 14 дней
Степень выраженности дистрофии гепатоцитов	--	+/++	+	++/+++	+	+++	+
Степень выраженности полнокровия	+/++	++/+++	+/++	+	++/+++	+	+++
Феномен сепарации крови	--	+/--	+/--	+/--	+	+/--	+
Кол-во гепатоцитов в состоянии дистрофии	37,2±4,08	124,58±9,7*	41±3,9	158,8±10,6*	48,3±3,5	166,8±11,9*	59±8,9*
Кол-во неизмененных гепатоцитов	431,5±24,9	143,7±11,9*	383,9±11,7	67,5±6,87*	377,5 ±11,3	33,8±9,4*	364,7±14,3
Кол-во гепатоцитов в состоянии некроза	0	43,9±6,0*	15,5±2,64*	54,2±9,18*	22,5±1,18*	79,7±8,08*	28,5±3,8*
КНП	11,7±1,7	1,15±0,1*	9,3±0,7	0,41±0,05*	7,8±0,6*	0,2±0,06*	6,1±0,5*
Общее кол-во НПЭ	26,2±5,9	47,5±3,67*	60±8,9*	38,1±3,21	67,8±8,6*	55,3±7,21*	77,6±12,3*
Кол-во лимфоцитов	17,6±4,24	38,2±3,04*	50,5±8,49*	25,8±5,98	48,5±3,7*	32,5±7,6	52,16±6,4*
Кол-во клеток Купфера и Ито	8,5±2,29	9,33±1,49	10,2±2,8	14,7±1,85	20,2±3,45*	22,6±4,6*	27,8±6,46*
Кол-во двуядерных гепатоцитов	5,6±1,5	7±1,41	16,16±3,8*	8±1,87	17,7±1,48*	5,08±1,24	16,8±3,3*

П р и м еч а н и е : * – достоверность различий с группой контроля (Р<0,05).

водили с использованием t-критерия Стьюдента. Исследование корреляционной взаимосвязи между количественными признаками осуществляли при помощи метода Пирсона.

Результаты. Установлено, что выраженность и обратимость морфологических изменений в печени определялись как размером ЗНЧ, так и длительностью их введения (табл. 1–3). При этом с увеличением сроков эксперимента морфологические изменения в органе приобретали более выраженный характер.

В группах 8-дневного введения наиболее значимые морфологические изменения обнаружены при введении ЗНЧ размерами 2 и 50 нм: в цитоплазме гепатоцитов наблюдалась зернистая дистрофия и умеренно выраженные некробиотические изменения, в то время как в группе животных с введением ЗНЧ 15 нм дистрофические изменения носили незначительный характер.

В результате исследования установили, что при 8-дневном введении ЗНЧ во всех опытных группах наблюдалось повышение количества дистрофически и некротически измененных гепатоцитов, уменьшение числа неизмененных клеток и, как следствие, снижение КНП. Максимальное количество гепатоцитов в состоянии дистрофии и некроза обнаружено в группе введения ЗНЧ 2 нм — 124,58±9,7 (Р<0,001); минимальное — в группе введения ЗНЧ 15 нм (82,7±6,18, Р<0,001). Уменьшение количества неизмененных клеток и повышение числа гепатоцитов в состоянии дистрофии и некроза сопровождалось снижением КНП до 1,15±0,12 (ЗНЧ 2 нм) и 1,2±0,126 (ЗНЧ 50 нм).

Длительное пероральное введение ЗНЧ сопровождалось повышением во всех опытных группах животных с 8-дневным введением ЗНЧ числа НПЭ как за счет лимфоцитов, так и за счет клеток Купфера и Ито. Полученные результаты свидетельствуют о наличии активирующего влияния ЗНЧ на моноцитарно- макрофагальную систему печени. Незначительное увеличение числа двуядерных гепатоцитов говорит об усилении регенераторных процессов.

Для уточнения размерозависимого влияния ЗНЧ на морфологическую картину печени выполнен корреляционный анализ, в ходе которого обнаружено большое количество достоверных отрицательных взаимосвязей между исследуемыми показателями и размером ЗНЧ. Важным моментом, установленным при корреляционном анализе, является тот факт, что максимальное повреждающее действие на печень оказали ЗНЧ размером 2 нм.

При гистологическом исследовании, выполненном через 14 дней после окончания введения ЗНЧ, во всех опытных группах наблюдалось восстановление морфологической картины печени: уменьшались степень выраженности дистрофии и некроза гепатоцитов, полнокровия сосудов и отека стромы. По данным морфометрического исследования, практически все исследуемые морфологические показатели печени приближались к контрольным значениям, кроме КНП и общего числа НПЭ в группах животных, которым вводили ЗНЧ 2 и 50 нм. Обращает на себя внимание увеличение количества двуядерных гепатоцитов во всех группах: в группе введения ЗНЧ 2 нм — в 2,9 раза; ЗНЧ 15 нм — в 3,1 раза и ЗНЧ 50 нм — в 3,2 раза.

С увеличением длительности введения ЗНЧ до 16 дней выраженность морфологических изменений нарастала: во всех опытных группах наблюдались дистрофия и некроз гепатоцитов, а также различной степени выраженности признаки нарушения кровообращения в органе, особенно в группе животных с введением ЗНЧ размером 50 нм. По данным морфометрического анализа, минимальные значения КНП получены в группах введения ЗНЧ 2 и 50 нм (0,41±0,05 и 0,31±0,07 соответственно) (рис. 1). Общее число НПЭ увеличивалось во всех опытных группах как за счет повышения количества лимфоци-

Таблица 2

Изменения гистологического строения печени с учетом длительности введения ЗНЧ размером 15 нм

Исследуемые показатели, M±m (в 30 полях зрения)	Контрольная группа	Длительность введения ЗНЧ размером 15нм
		8 дней		16 дней		30 дней
		В конце введения	Через 14 дней	В конце введения	Через 14 дней	В конце введения	Через 14 дней
Степень выраженности дистрофии гепатоцитов	--	+	+/--	++	+	++	+
Степень выраженности полнокровия	+/++	+/++	+/++	+	++	++	++/+++
Феномен сепарации крови	--	--	+/--	--	--	--	+
Кол-во гепатоцитов в состоянии дистрофии	37,2±4,08	82,7±6,18*	36,6±9,21	108,5±11,6*	44,3±6,4	148,8±10,5*	51,8±5,6
Кол-во неизмененных гепатоцитов	431,5±24,9	243±21,2*	393,8±17,4	151,4±10,3*	383,3±8,3	122±33,13*	375,7±10,8
Кол-во гепатоцитов в состоянии некрозов	0	26,3±3,16*	13±3,9*	40,6±3,7*	20,6±4,2*	59,7±8,9*	26,5±4,9*
КНП	11,7±1,7	2,9±0,23*	10,6±1,7	1,4±0,18*	8,6±0,78	0,82±0,43*	7,65±0,7
Общее число НПЭ	26,2±5,9	51,4±11,04*	44,3±4,9*	50±4,17*	52,7±6,7*	59,4±14,16*	44,6±9,5*
Кол-во лимфоцитов	17,6±4,24	38,3±9,12*	33,7±3,6*	29,6±1,9*	40,5±8*	36,3±11,8*	30,6±6,65*
Кол-во клеток Купфера и Ито	8,5±2,29	13,4±2,55	10,5±2,29	19,3±3,7*	11,2±2,16	23,1±3,9*	15,1±5,57*
Кол-во двуядерных гепатоцитов	5,6±1,5	6,7±1,5	17,4±2,29*	7,2±1,24	17±2,7*	6,9±1,8	18,5±1,7*

П р и м еч а н и е : * – достоверность различий с группой контроля (Р<0,05).

Таблица 3

Изменения гистологического строения печени с учетом длительности введения ЗНЧ размером 50 нм

Исследуемые показатели, M±m (в 30 полях зрения)	Контрольная группа	Длительность введения ЗНЧ размером 50 нм
		8 дней		16 дней		30 дней
		В конце введения	Через 14 дней	В конце введения	Через 14 дней	В конце введения	Через 14 дней
Степень выраженности дистрофии гепатоцитов	--	++	+	++/+++	+	+++	+
Степень выраженности полнокровия	+/++	+/++	+++	+/++	++/+++	++/+++	++/+++
Феномен сепарации крови	--	--	+/--	--	--	--	+/--
Кол-во гепатоцитов в состоянии дистрофии	37,2±4,08	99,08±10,9*	42,3±6,7	170,5±8,43*	53,5±8,25	205±15,1*	62,3±7,9*
Кол-во неизмененных гепатоцитов	431,5±24,9	122,8±9,8*	385,5±23,9	53,9±9,62*	386,7±11,5	20,6±6,34*	379,4±15,3
Кол-во гепатоцитов в состоянии некрозов	0	31,6±6,38*	23,7±4,6*	45,5±7,9*	33,7±4,39*	96,8±8,5*	51,2±5,9*
КНП	11,7±1,7	1,2±0,126*	9,1±0,7	0,31±0,07*	7,2±0,68	0,09±0,03*	6,2±0,56*
Общее число НПЭ	26,2±5,9	34±4,17	68,5±9,79*	49,4±3,36*	61,8±9*	64,9±8,05*	42,3±8,8*
Кол-во лимфоцитов	17,6±4,24	23,9±4,46*	55,4±8,25*	38,8±2,9*	41±7,8*	39,6±5,14*	27,6±6*
Кол-во клеток Купфера и Ито	8,5±2,29	10±2	13,16±2,6	11,4±1,16	19,3±3,7*	26,9±4,12*	14,58±3,3
Кол-во двуядерных гепатоцитов	5,6±1,5	8,4±2,15	18,4±2,57*	6,4±1,3	15,58±2,23*	6,41±1,8	15,5±2,46*

П р и м еч а н и е : * – достоверность различий с группой контроля (Р<0,05).

тов, так и за счет увеличения числа клеток Купфера и Ито.

При изучении обратимости во всех опытных группах с 16-дневным введением ЗНЧ выраженность дистрофических и некротических изменений в гепатоцитах уменьшалась (рис. 2). Следует отметить, что минимальное количество гепатоцитов в состоянии дистрофии (44,3±6,4; Р<0,001) и максимальное значение КНП (8,6±0,78; Р<0,001) были получены в группе животных, которым вводили ЗНЧ 15 нм. Изменения со стороны моноцитарно-макрофагальной системы печени в группах введения ЗНЧ 2 и 50 нм носили однонаправленный характер и проявлялись в виде увеличения практически в два раза общего количества НПЭ как за счет повышения количества лимфоцитов, так и клеток Купфера и Ито. Увеличение количества двуядерных гепатоцитов наблюдалось во всех опытных группах: в 3 раза в ответ на

Рис. 1. Умеренно выраженные дистрофические изменения гепатоцитов. ЗНЧ размером 2 нм, 16-дневное введение.

Окр. Г.-Э. Ув. 774

Рис. 4. Выраженная дистрофия гепатоцитов при 30-дневном введении ЗНЧ 50 нм.

Окр. Г.-Э. Ув. 774

Рис. 2. Слабая дистрофия гепатоцитов на 14-й день после окончания 16-дневного введения ЗНЧ 2 нм. Окр. Г.-Э. Ув.

774.0

Рис. 5. Незначительная степень дистрофии гепатоцитов на 14-й день после окончания введения ЗНЧ 2 нм в течение 30 дней. Окр. Г.-Э. Ув. 774.0

Рис. 3. Выраженные дистрофические изменения гепатоцитов при 30-дневном введении ЗНЧ размером 2 нм.

Окр. Г.-Э. Ув. 774

введение ЗНЧ размером 2 нм, в 2,3 раза — ЗНЧ 15 нм и в 2,8 раза — ЗНЧ 50 нм.

Наиболее выраженные изменения найдены в группах 30-дневного введения ЗНЧ размерами 2 и 50 нм. В препаратах данных групп обращало на себя внимание отсутствие балочного строения, выраженная вакуольная дистрофия гепатоцитов (рис. 3; 4). Следует отметить, что в группе животных, которым вводили ЗНЧ 15 нм, балочное строение гепатоцитов было сохранено, отмечалась умеренная дистрофия гепатоцитов.

По данным морфометрического исследования, во всех группах с 30-дневным введением ЗНЧ отмечалось дальнейшее уменьшение количества неизмененных гепатоцитов и КНП, при этом минимальные значения КНП (0,09±0,03) получены при введении ЗНЧ 50 нм. Общее число НПЭ печени увеличилось в два раза как за счет повышения количества лимфоцитов, так и за счет увеличения числа клеток Купфера и Ито. Количество двуядерных гепатоцитов увеличивалось незначительно.

При морфологическом исследовании печени через 14 дней после окончания 30-дневного введения ЗНЧ наблюдалось частичное восстановление струк-

а)

Рис. 6. Экспрессия антигена ядерного белка Ki-67: а) в контрольной группе; б) при 30-дневном введении ЗНЧ 2 нм.

ИГХ-реакция с антителами к Ki-67-антигену. Ув. 774

б)

туры органа, уменьшалась выраженность дистрофии и некроза, значительное увеличение КНП (рис. 5). В то же время изменения со стороны моноцитарно-макрофагальной системы носили разнонаправленный характер. В группах животных с введением ЗНЧ 2 и 50 нм во всех случаях к 14-м суткам и по окончании их введения регистрировали дальнейшее повышение количества НПЭ. Исключение составили группы животных, которым вводили ЗНЧ 50 нм в течение 30 дней, где на 14-е сутки после окончания введения отмечали 1,5-кратное снижение количества НПЭ по отношению к исходному значению и с введением ЗНЧ 15 нм, в которой на 14-й день после прекращения 8-и 30-дневного введения ЗНЧ также отмечалась тенденция к снижению общего числа НПЭ.

Учитывая, что в печени в группах 30-дневного введения ЗНЧ были получены наиболее выраженные морфологические изменения, провели ИГХ-исследование с маркером Ki-67 для оценки пролиферативной активности гепатоцитов в ответ на повреждающее воздействие ЗНЧ. Иммуногистохимическая реакция с маркером Ki-67 наблюдалась во всех группах животных ЗНЧ: среднее значение гистосчета в группе введения ЗНЧ размером 2 нм составило 144,4±12,4, ЗНЧ размером 15 нм — 141,5±10,3, ЗНЧ размером 50 нм — 150,3±13,2 (при контрольных значениях 4,14±1,04, Р<0,001) (рис. 6). При исследовании обратимости среднее значение гистосчета уменьшилось и составило в группе введения ЗНЧ размером 2 нм 102,3±8,2, ЗНЧ размером 15 нм — 98±7,4, ЗНЧ размером 50 нм — 123±11,5.

Обсуждение. Увеличение числа двуядерных гепатоцитов мы расценивали как проявление процессов регенерации, направленных на восстановление печёночной ткани за счёт увеличения количества функционирующих гепатоцитов. Это согласуется с мнением В. В. Садовниковой и др. (2001) о том, что повышение количества функционирующих гепатоцитов свидетельствует об усилении белково-синтетической функции печени, что может расцениваться как единый компенсаторно-приспособительный механизм, направленный на нормализацию структуры и функции органа [13].

При морфологическом исследовании печени не обнаружено скопления ЗНЧ при использовании световой микроскопии, ни при микроскопии методом темного поля. Мы зарегистрировали лишь косвенные признаки присутствия ЗНЧ в виде дистрофических и некротических изменений паренхимы и активации моноцитарно-макрофагальной системы.

Заключение. Таким образом, морфологические изменения в печени при длительном пероральном введении ЗНЧ зависят как от размера частиц, так и от длительности их введения. Развивающиеся патологические изменения в печени носят обратимый характер, о чем свидетельствует постепенное восстановление структуры органа через 14 дней после окончания эксперимента.