Морфологические изменения в тканях головного мозга при экспериментальной ишемии

Высокие показатели летальности и инвалидизации больных инсультом обусловливают особую актуальность проблемы. В Европе заболеваемость инсультом составляет 220 случаев на 100 000 населения в год. Распространенность инсульта приближается к 600 на 100 000 населения, из них 360 (т. е. 60 %) – со стойким дефектом, и только около 15 % больных возвращаются к прежнему до инсультному уровню жизни [1].

Противоречивость данных об особенностях метаболизма нейроцитов, факторах апоптоза в мозговых тканях в динамике ишемии-реперфузии [2–3], а также сложность прогнозирования эффективности реабилитации у больных инсультом [4–5] определили целесообразность проведения морфологических исследований при экспериментальной ишемии головного мозга в различные сроки после реперфузии. Результаты этих исследований позволят, в определенной степени, представить взаимосвязь морфологических изменений в тканях головного мозга в различные сроки ишемии-реперфузии, выделить лимитирующие звенья в системе факторов апоптоза, что может стать предпосылкой для разработки патогенетически обоснованных путей повышения эффективности способов реабилитации.

Целью настоящего исследования стал морфологический анализ тканей головного мозга в различные сроки после экспериментальной ишемии-реперфузии.

Методы исследования.

Работа проведена на крысах-самцах весом 120–130 г, находящихся на стандартном рационе вивария. Модель нарушения мозго-

Для морфологического изучения фрагменты тканей головного мозга объёмом 0,2– 0,3 мм³ фиксировали в 12 % растворе формалина по общепринятой методике [6]. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином – эозином. Иммуногистохимические исследования Bcl -2 проводили набором DAKO Citoma-tion LCAB -2 (Дания) моноклональными первичными мышиными и кроличьими антителами к Bcl -2, содержащими стрептолизин-био-тин ( LCAB ), предназначенными для качественного определения в парафиновых срезах с помощью светооптической микроскопии при окраске гематоксилин-эозином. Светооптические микрофотографии получали на микроскопе « N- 800 M » c использованием цифровой камеры, сопряженной с оптической системой микроскопа с помощью специального адаптера.

Все права защищены

1(23)2015

ISSN 2226-3365

Полученные результаты.

Гистопатологические изменения в коре левых височных долей крыс после перенесенной экспериментальной ишемии имели определённую динамику развития во времени.

При пережатии у крыс левой сонной артерии наблюдались изменения, характерные для патологической картины кислородной недостаточности, так как сравнительно слабое развитие у крыс артериального круга большого мозга не создаёт достаточного кровоснабжения. Патологические изменения нервных клеток при гипоксии характеризовались, прежде всего, полиморфизмом. Началом структурных изменений нервных клеток при гипоксии-реоксигенации стало наличие хроматолиза различной степени через один час после восстановления кровотока по левой сонной артерии после ее пережатия. Повреждения нейронов начинались с появления периферического, центрального или сегментарного хроматолиза. Первые признаки хроматолиза обнаруживались в отдельных нервных клетках и сосудах в образцах коры, правой и левой височной области головного мозга крыс. Выявление начальных проявлений отёка мозга характеризовалось набуханием и увеличением в размерах, бледностью окрашивания нервных клеток, появлением бледных межклеточных полей нейроглии (рис.1).

При исследовании коры височных долей головного мозга крыс через один час после реперфузии с помощью моноклональных меченых Bcl -2 клеток реакции розеткообразования не обнаружено, что указывает на отсутствие активации апоптоза в этот период (рис. 2).

Рисунок 1

Кора правой височной области головного мозга крыс через один час после окклюзии – реперфузии

Примечание. Окраска гематоксилин-эозином.

Увеличение: об. 40, ок. 10.

Рисунок 2

Кора левой височной области головного мозга крыс через один час после окклюзии – реперфузии

Примечание. Реакции взаимодействия Bcl-2

меченых моноклональных антител с клетками не наблюдается. Окраска гематоксилин-эозином.

Увеличение: об. 40, ок. 10.

Через шесть часов после окклюзии – реперфузии проявления хроматолиза достигали отчётливой выраженности, морфологические изменения становились более распространёнными и резкими, отмечалось острое набухание

Все права защищены

1(23)2015

ISSN 2226-3365

тел многих нейронов, распыление тигроида и базофилия ядер. Хроматолиз, как показатель реактивных изменений нервных клеток, отражает нарушения обмена функциональных белков [7], наблюдающегося в первые шесть часов после реоксигенации.

При исследовании коры височных долей головного мозга крыс с помощью моноклональных меченых Bcl -2 клеток через шесть часов после окклюзии – реперфузии в поле зрения светового микроскопа выявлялись единичные комплексы клеточного розет-кообразования, где один нейрон окружён множеством Bcl -2 клеток (рис. 3), что указывает на начало развития апоптотической гибели клеток мозга.

Рисунок 3

Единичный нейрон в окружении множества моноклональных меченых Bcl-2 клеток через шесть часов после окклюзии – реперфузии

Примечание. Окраска гематоксилин-эозином.

Увеличение: об. 40, ок. 10.

В течение 24–36 часов после реперфузии хроматолиз продолжал нарастать, в процесс вовлекались структурные белки клеток, распад которых выявлялся светооптически в виде инкрустаций, продуктов распада цитоплазмы, интенсивно окрашенных базофильных глыбок, которые формировались в течение первых суток после окклюзии – реперфузии и заканчиваются появлением клеток теней и картинами нейронофагии.

Как известно, повреждение структурных белков и липидов клетки включает в себя и изменения липопротеинов клеточных мембран, что свидетельствует об ещё большем нарушении электролитного и водного баланса клетки [8]. В результате этого, уже начиная с ранних стадий процесса, хроматолиз нередко сочетался с гидропическими изменениями, что выражалось в вакуолизации различной степени, увеличении размеров клетки, округлении её контуров, иногда с явлениями острого или сотовидного набухания тел нервных клеток.

Хроматолиз и гидропические изменения цитоплазмы в первые 24 часа после перенесенной гипоксии сопровождались морфологическими признаками компенсаторно-восстановительных реакций, которые выражались в гипертрофии и гиперхромности эктопированного к ядерной мембране ядрышка, перинуклеарном гиперхроматозе.

Через 24 часа после реперфузии в исследуемых образцах имелся тотальный тигролиз и гиперхроматоз ядер в преобладающем большинстве нейронов, «инкрустация» клеток, ка-риоцитолиз, «клетки-тени». Одни нейроны имели сотовидную цитоплазму, другие были тотально темноокрашенными, тела их были узкие, вытянутые. Во многих нейронах имелась центральная тинкториальная ацидофилия.

Наблюдалась дистония сосудистых стенок, утолщение и огрубление аргирофильных волокон, периваскулярные отёки и нередко мелкие периваскулярные кровоизлияния. Гипоксические нейроны с инкрустациями характеризовались наличием интенсивно окрашенных базофильных зёрен по периферии клетки,

Все права защищены

1(23)2015

ISSN 2226-3365

иногда по краю цитоплазмы имелась более тёмная базофильная каёмка.

Исследование коры височных долей головного мозга крыс с помощью моноклональных меченых Bcl -2 клеток через 24 часа после окклюзии – реперфузии показало наличие в поле зрения светового микроскопа хаотичного распределения Bcl -2 клеток, отсутствие их концентрирования вокруг нейроцитов и отсутствие связи с ними (рис. 4). Как результат этого, ожидалась резко отрицательная динамика с появлением очагового некроза.

темноокрашенность некоторых нейронов, уменьшение в размерах нейрональных клеток. Инкрустации нередко сочетались с появлением в клетках различных зернистостей, что проявлялось бледностью цитоплазмы, количество несвязанных Bcl -2 клеток было незначительным (рис. 5). Известно, что пикнотичные ядра могут значительно дольше обнаруживаться на фоне цитоплазмы, постепенно превращающейся в тень, в виде гиперхромных, неправильной формы, распадающихся на мелкие зёрна и глыбки, угловатых образований [9–10].

Рисунок 4

Хаотичное распределение Bcl-2 позитивных клеток вне их связи и расположения вокруг нейронов через 24 часа после окклюзии – реперфузии

Примечание. Окраска гематоксилин-эозином.

Увеличение: об. 40, ок. 10.

Рисунок 5

Обеднение нейрональными клетками с незначительным количеством несвязанных Bcl-2 клеток коры через трое суток после окклюзии – реперфузии

Примечание. Окраска гематоксилин-эозином.

Увеличение: об. 40, ок. 10.

Через трое суток наблюдалось изменение морфологической картины. С одной стороны, можно было отметить некоторые признаки восстановления – снова начинал окрашиваться распылённый на мелкие глыбки тигроид, светлее становились ядра нейронов. С другой – продолжалось нарастание патологических процессов, появление вакуолизации,

Рисунок 6

Все права защищены

1(23)2015

ISSN 2226-3365

Зона некротического расплавления левой височной области головного мозга крысы на седьмые сутки после окклюзии – реперфузии Примечание. Независимое расположение Bcl-2 клеток. Окраска гематоксилин-эозином.

Увеличение: об. 40, ок. 10.

Усиление выраженности вакуолизации с образованием некротических полостей в зонах максимальной ишемии и зоны опустошения характеризовали происходящие морфологические процессы на седьмые сутки (рис. 6).

Заключение

При экспериментальной окклюзии-реоксигенации головного мозга наблюдающиеся изменения нарастают во времени после реперфузии. Наибольшие изменения обнаружены через шесть часов после реперфузии, когда появляются первые признаки апоптоза, а на седьмые сутки апоптотическая гибель нейроцитов сменяется некротическим процессом, о чем свидетельствует зона некротического расплавления и независимое расположение Bcl -2 клеток в образцах. Морфологические изменения в тканях головного мозга проявляются в основном в виде отека, хроматолиза и достигают отчётливой выраженности через 24 часа после реперфузии, характеризуясь острым набуханием тел многих нейронов, распылением тигроида и базофилией ядер.