Морфологические изменения в зонах Са1 и Са3 гиппокампа крыс при принудительной хронической алкоголизации и фармакологической коррекции соединениями сукцикард и цитрокард

Изучение клеточных и молекулярных механизмов алкоголь-индуцированного повреждения головного мозга имеет значительный интерес с позиции понимания сущности нейродеге-неративных изменений [5]. Известно, что алкогольная интоксикация вызывает активацию компенсаторно-приспособительных процессов в головном мозге с преобладанием атрофии [10]. Патогенез алкогольного поражения включает в себя основные механизмы повреждения головного мозга, такие как эксайтотоксичность, оксидативный стресс, нейровоспаление, активация апоптоза [1, 7, 11]. Таким образом, особенности метаболических нарушений в головном мозге при алкогольной интоксикации влекут за собой сосредоточенное внимание ученых с целью разработки препаратов, направленных на коррекцию последствий алкоголизации [9]. Среди патогенетических средств, направленных на коррекцию нейродегенеративных изменений, особое внимание привлекают естественные метаболиты нервной системы и их аналоги [2, 3, 12], к таким представителям относятся соединения сукцикард [6] и цитрокард [4]

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

С помощью морфометрических методик исследовать структурные изменения в зонах CA1 и CA3 пирамидного слоя гиппокампа крыс при моделировании экспериментальной хронической алкоголизации и фармакологической коррекцией соединениями сукцикард и цитрокард.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование проведено на белых лабораторных крысах самцах 6-месячного возраста исходной массы 220–240 г, группы контроля (n = 10) и экспериментальной группы (n = 10). Содержание животных соответствовало правилам лабораторной практики (GLP) и приказу МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики», были учтены требования комиссии Российского национального комитета по биоэтике при Российской академии наук. Хронический алкоголизм моделировался на крысах путем замены питьевой воды 5%-м этиловым спиртом, подслащенным сахарозой (5 г сахара на 100 мл 5%-го раствора этанола) в течение 20 недель. По истечении 20-недельного срока крысы выводились из эксперимента. Декапитацию проводили гильотинным методом, фиксировали образцы головного мозга в 10 %-м забуференном формалине. По стандартной методике изготавливали парафиновые блоки и срезы толщиной 5–7 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином, толуидиновым синим по методу Ниссля. Проводили качественный и количественный анализ пирамидного слоя гиппокампа. Исследование микропрепаратов проводилось с помощью микроскопа «Axio Lab. A1», фотодокументирование осуществляли камерой «AxioCam 105 color». Статистическую обработку данных проводили с использованием пакетов программ Excell и Statistica 6,0. Данные представляли в виде медианы с указанием интерквартильного интервала. Различия между группами оценивали по критерию Манна-Уитни, Краскела-Уоллиса и считали статистически значимыми при p < 0,05. Для проведения количественного анализа гистологических препаратов использовались морфометрические методы, с помощью которых были описаны планиметрические свойства нейронов и их структур. Среди планиметрических свойств нейронов определялись абсолютные показатели нейронов, такие как площадь перикарионов, площадь ядер нейронов, площадь цитоплазмы нейронов выполнены измерения толщины пирамидного слоя гиппокампа. На основании полученных абсолютных показателей нейронов рассчитан относительный показатель – медиана относительной плотности нейропиля в пирамидном слое и определены медианы ядер-но-цитоплазматического отношения нейронов гиппокампа.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИСЛЕДОВАНИЯИ ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При морфометрической оценке абсолютных показателей пирамидного слоя в зоне СА1 выявлено (табл. 1), что площадь перикарионов нейронов пирамидного слоя гиппокампа в группе «Сук-цикард» меньше по сравнению с группой «Цитро-кард» на 22,98 %. В группе «Сукцикард» площадь перикарионов составила Ме 88,38 [77,96; 102,28] мкм², данное значение на 18,3 % больше, чем в группе алкоголя, и на 7,57 % меньше, чем в группе интакта. В группе «Цитрокард» площадь перикарионов составила Ме 114,76 [102,73; 126,27] мкм², данное значение на 37,14 % больше, чем в группе алкоголя, и на 16,67 % больше, чем в группе интакта [8], сравнение всех групп методом Kruskal-Wallis: р = 0,000.

Таблица 1

Зона гиппокампа	Морфометрические показатели	Итоги измерения и вычисления морфометрических показателей
		Интактная группа	Алкоголизиро-ванная группа	Группа «Сукцикард»	Группа «Цитрокард»
СА1	Медиана площади перикарионов, мкм²	Kruskal-Wallis test: H ( 3		, N = 848) = 341,3013 p = 0,000
		95.62 [72,81; 110,19]	72.13 *** [61,61; 82,86]	88,38 [77,96; 102,28]	114,76 [102,73; 126,27]
	Медиана площади ядер, мкм²	Kruskal-Wallis test: H ( 3, N= 848) =397,4102 p =0,000
		67,59 [50,43; 79,01]	46,72 *** [40,44; 55,05]	65,44 [57,32; 77,18]	86,6 [78,62; 96,19]
	Медиана площади цитоплазмы перикарионов, мкм²	Kruskal-Wallis test: H ( 3, N= 947) =72,62015			p =,0000
		28,91 [22,65; 36,16]	25,01 ** [21,69; 30,95]	22,87 [18,80; 27,22]	26,94 [21,19; 32,66]
	Медиана ядерно-цитоплазма-тического отношения нейронов гиппокампа, число	Kruskal-Wallis test: H ( 3, N= 947) =390,0475			p =0,000
		2,45 [2,01; 2,87]	1,79 *** [1,53; 2,09]	2,9 [2,53; 3,44]	3,2 [2,65; 3,93]
	Медиана толщины пирамидного слоя, мкм	Kruskal	-Wallis test: H ( 3	, N= 2112) =235,5526 p =0,000
		32,3 [27,9; 38,3]	22,9 *** [19,4; 28,8]	26,64 [21,25; 32,33]	31,61 [25,48; 38,14]
	Медиана относительной плотности нейропиля, %	Kruskal-Wallis test: H ( 3, N= 126) =18,05835			p =0,004
		29,87 [25; 32,62]	38,89 ** [30.37; 46,8]	27,94 [23,29; 31,64]	30,69 [26,3; 36,94]

* Различия между группами (интакт – алкоголь) статистически значимы (критерий Манна–Уитни).

Изменения морфометрических показателей гиппокампа в зоне СА1

Площадь ядер нейронов пирамидного слоя гиппокампа в группе «Сукцикард» меньше по сравнению с группой «Цитрокард» на 24,4 %. В группе «Сукцикард» площадь ядер нейронов составила Ме 65,44 [57,32; 77,18] мкм², данное значение на 28,6 % больше, чем в группе алкоголя, и на 3,18 % меньше, чем в группе интакта. В группе «Цитрокард» площадь перикарионов составила Ме 86,6 [78,62; 69,19] мкм², данное значение на 46,05 % больше, чем в группе алкоголя, и на 21,95 % больше, чем в группе ин-такта [8], сравнение всех групп методом Kruskal-Wallis: р = 0,000.

Площадь цитоплазмы нейронов пирамидного слоя гиппокампа в группе «Сукцикард» меньше по сравнению с группой «Цитрокард» на 15,1 %. В группе «Сукцикард» площадь перикарионов составила Ме 22,87 [18,80; 27,22] мкм², данное значение на 8,55 % меньше, чем в группе алкоголя, и на 20,89 % меньше, чем в группе интакта, в группе «Цитрокард» площадь перикарионов составила Ме 26,94 [21,19; 32,66] мкм², данное значение на 7,16 % больше, чем в группе алкоголя, и на 6,81 % меньше, чем в группе интакта [8], сравнение всех групп методом Kruskal-Wallis: р = 0,000.

Ядерно-цитоплазматическое отношение (ЯЦО) нейронов пирамидного слоя гиппокампа в группе «Сукцикард» меньше по сравнению с группой «Цитрокард» на 9,37 %. В группе «Сук-цикард» ЯЦО нейронов составила Ме 2,9 [2,53; 3,44] мкм², данное значение на 38,27 % больше, чем в группе алкоголя, и на 15,51 % больше, чем в группе интакта. В группе «Цитрокард» ЯЦО нейронов составила Ме 3,2 [2,65; 3,93] мкм², данное значение на 44,06 % больше, чем в группе алкоголя, и на 23,4 % больше, чем в группе интакта [8], сравнение всех групп методом Kruskal-Wallis: р = 0,000.

Толщина пирамидного слоя гиппокампа в группе «Сукцикард» меньше по сравнению с группой «Цитрокард» на 15,72 %. В группе «Сукцикард» толщина пирамидного слоя составила Ме 26,64 [21,25; 32,33] мкм², данное значение на 14,03 % больше, чем в группе алкоголя, и на 17,52 % меньше, чем в группе интакта. В группе «Цитрокард» толщина пирамидного слоя составила Ме 31,61 [25,48; 38,14] мкм², данное значение на 27,55 % больше, чем в группе алкоголя, и на 2,13 % меньше, чем в группе интакта [8], сравнение всех групп методом Kruskal-Wallis: р = 0,000.

Относительная плотность нейропиля пирамидного слоя гиппокампа в группе «Сукци-кард» меньше по сравнению с группой «Цитро-кард» на 8,96 %. В группе «Сукцикард» плотность нейропиля составила Ме 27,94 [23,29; 31,64] мкм², данное значение на 28,15 % меньше, чем в группе алкоголя, и на 6,46 % меньше, чем в группе интакта. В группе «Цитрокард» плотность нейропиля составила Ме 30,69 [26,3;36,94] мкм², данное значение на 21,08 % меньше, чем в группе алкоголя, и на 2,67 % больше, чем в группе интакта [8], сравнение всех групп методом Kruskal-Wallis: р = 0,000.

Рис. 1. Ув. х40. Гистологические строение гиппокампа (зона СА1) у интактных животных (А), гиперхромность ядер и цитоплазмы нейронов более выражена в сравнении с интактной группой, уменьшение размеров перикарионов нейронов, уменьшение толщины пирамидного слоя до 1–2 нейронов в зоне СА1 у алкоголизированных животных (Б), увеличение толщины пирамидного слоя до 3–4 нейронов, определяется многоклеточность пирамидного слоя, увеличение размеров перикарионов и ядер нейронов, увеличение количества светлых ядер, наиболее выраженная васкуляризация краевого и радиального слоев гиппокампа у группы «Сукцикард» (В) и «Цитрокард» (Г)

При морфометрической оценке абсолютных показателей пирамидного слоя в зоне СА3 выявлено, что площадь перикарионов нейронов пирамидного слоя гиппокампа в группе «Сукци-кард» больше по сравнению с группой «Цитро-кард» на 3,26 % (табл. 2). В группе «Сукцикард» площадь перикарионов составила Ме 132,77 [122,15; 145,59] мкм², данное значение на

23,53 % больше, чем в группе алкоголя, и на 20,17 % больше, чем в группе интакта. В группе «Цитрокард» площадь перикарионов составила Ме 128,44 [115,86; 147,69] мкм², данное значение на 20,95 % больше, чем в группе алкоголя, и на 20,2 % больше, чем в группе интакта [8], сравнение всех групп методом Kruskal-Wallis: р = 0,000.

Таблица 2

Зона гиппокампа	Морфометрические показатели	Итоги измерения и вычисления морфометрических показателей
		Интактная группа	Алкоголизированная группа	Группа «Сукцикард»	Группа «Цитрокард»
СА3	Медиана площади перикарионов, мкм²	Kruskal-Wallis test: H ( 3, N= 389) =93,86345 p =0,000
		102,49 [95,47; 112,52]	101,52 [88,05; 120,87]	132,77 [122,15; 145,59]	128,44 [115,86; 147,69]
	Медиана площади ядер, мкм²	Kruskal-Wallis test: H ( 3, N= 452) =171,2730 p =0,000
		67,23 [62,09; 76,31]	63,39 * [54,48; 76,29]	93 [81,90; 103,51]	94,81 [85,06; 106,75]
	Медиана площади цитоплазмы перикарионов, мкм²	Kruskal-Wallis test: H ( 3, N= 544) =84,06739 p =0,000
		30,31 [26,14; 37,03]	42,16 *** [33,83; 51,35]	39,11 [34,37; 45,64]	32,6 [27; 43,57]
	Медиана ядерно-цитоплазматического отношения нейронов гиппокампа, число	Kruskal-Wallis test: H ( 3, N= 544) =216,0157 p =0,000
		2,14 [1,77; 2,52]	1,6 *** [1,33; 1,91]	2,32 [1,95; 2,66]	2,82 [2,34; 3,41]
	Медиана толщины пирамидного слоя, мкм	Kruskal-Wallis test: H ( 3, 1		N= 1012) =133,4284 p =0,000
		37,3 [32,3; 42,4]	31,4 *** [26,3; 36,9]	25,36 [19,1; 32,32]	27,62 [19,12; 35,12]
	Медиана относительной плотности нейропиля, %	Kruskal-Wallis test: H ( 3, N= 93) =10,76171 p =			0,131
		33,12 [26,9; 38,44]	36,09 [63,68; 31,21]	31,64 [23,7; 45,42]	41,16 [36,43; 46,15]

* Различия между группами (интакт – алкоголь) статистически значимы (критерий Манна–Уитни).

Изменения морфометрических показателей гиппокампа в зоне СА3

Площадь ядер нейронов пирамидного слоя гиппокампа в группе «Сукцикард» меньше по сравнению с группой «Цитрокард» на 1,9 %. В группе «Сукцикард» площадь ядер нейронов составила Ме 93 [81,90; 103,51] мкм², данное значение на 31,83 % больше, чем в группе алкоголя, и на 27,7 % больше, чем в группе интак-та. В группе «Цитрокард» площадь ядер нейронов составила Ме 94,81 [85,06;106,75] мкм², данное значение на 33,13 % больше, чем в группе алкоголя, и на 29,08 % больше, чем в группе интакта [8], сравнение всех групп методом Kruskal-Wallis: р = 0,000.

Площадь цитоплазмы нейронов пирамидного слоя гиппокампа в группе «Сукцикард» больше по сравнению с группой «Цитрокард» на 16,64 %. В группе «Сукцикард» площадь цитоплазмы перикарионов составила Ме 39,11 [34,37; 45,64] мкм², данное значение на 7,23 % меньше, чем в группе алкоголя, и на 22,5 % больше, чем в группе интакта. В группе «Цитро-кард» площадь цитоплазмы перикарионов составила Ме 32,6 [27; 43,57] мкм², данное значение на 22,67 % меньше, чем в группе алкоголя, и на 7,02 % больше, чем в группе интакта [8], сравнение всех групп методом Kruskal-Wallis: р = 0,000.

Ядерно-цитоплазматическое отношение (ЯЦО) нейронов пирамидного слоя гиппокампа в группе «Сукцикард» меньше по сравнению с группой «Цитрокард» на 17,73 %. В группе «Сукцикард» ЯЦО нейронов составила Ме 2,32 [1,95; 2,66] мкм², данное значение на 31,03 % больше, чем в группе алкоголя, и на 7,75 % больше, чем в группе интакта. В группе «Цитро-кард» ЯЦО нейронов составила Ме 2,82 [2,34; 3,41] мкм², данное значение на 43,26 % больше, чем в группе алкоголя, и на 24,11 % больше, чем в группе интакта [8], сравнение всех групп методом Kruskal-Wallis: р = 0,000.

Толщина пирамидного слоя гиппокампа в группе «Сукцикард» меньше по сравнению с группой «Цитрокард» на 8,18 %. В группе «Сук-цикард» толщина пирамидного слоя составила Ме 25,36 [19,1; 32,32] мкм², данное значение на 19,23 % меньше, чем в группе алкоголя, и на 32,01 % больше, чем в группе интакта. В группе «Цитрокард» толщина пирамидного слоя составила Ме 27,62 [16,12; 35,12] мкм², данное значение на 12,03 % меньше, чем в группе алкоголя, и на 25,95 % меньше, чем в группе интакта [8], сравнение всех групп методом Kruskal-Wallis: р = 0,000.

Относительная плотность нейропиля пирамидного слоя гиппокампа в группе «Сукци-кард» меньше по сравнению с группой «Цитро-кард» на 23,12 %. В группе «Сукцикард» относительная плотность нейропиля составила Ме 31,64 [23,7; 45,42] мкм², данное значение на 12,25 % меньше, чем в группе алкоголя, и на 4,46 % меньше, чем в группе интакта. В группе «Цитрокард» относительная плотность нейропиля составила Ме 41,16 [36,43; 46,15] мкм², данное значение на 12,31 % больше, чем в группе алкоголя, и на 19,53 % больше, чем в группе интакта [8], сравнение всех групп методом Kruskal-Wallis: р = 0,000.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исходя из полученных ранее данных, следует вывод о том, что количественное морфологическое исследование гиппокампа зон СА1 и СА3 алкоголизированных животных демонстрирует развитие процессов повреждения и активации компенсаторно-приспособительных процессов с преобладанием атрофии [8], однако количественные данные, полученные при исследовании гиппокампа зон СА1 и СА3 экспериментальных групп животных, получавших соединения сукцикард и цитрокард, демонстрируют обратное развитие процессов повреждения с атрофией нейронов пирамидного слоя гиппокампа и характеризуются развитием гипертрофии. По данным количественного морфометрического анализа, можно сделать вывод о том, что у животных, получавших соединение Цит-рокард, в гиппокампе в зонах СА1 и СА2 отмечен наиболее выраженный нейропротективный эффект, в свою очередь, менее выраженные нейропротективные изменения определялись в группе животных, получавших соединения сук-цикард. Приведенные нами объективные морфометрические данные могут свидетельствовать об эффективности рассматриваемых соединений, с позиции снижения степени выраженности нейронального повреждения и, в свою очередь, подтверждают, что разработка лекарственных средств на основе естественных метаболитов нервной системы и их аналогов является актуальной [4, 6].