Морфологические особенности базидиального гриба Pleurotus pulmonarius в поверхностной и глубинной культуре

Для изучения особенностей роста в различных биотехнологических системах и определения макро- и микроморфологических признаков Pleurotus pulmonarius проводили культивирование штамма в поверхностных и глубинных условиях. Поверхностное культивирование осуществляли на сусловом агаре в чашке Петри при температуре 26Д 0 С в течение 7 суток. С целью стандартизации посевов в качестве посевного материала для поверхностного культивирования использовали агаровые блоки воздушного мицелия, вырезанные пробойным сверлом диаметром 8 мм из краевой зоны роста семисуточной культуры, выращенной на чашке Петри.

Глубинное культивирование проводили в стационарном лабораторном биореакторе CeCa (Gallenkamp controlled environment culture apparatus Cx650, made in England BY) в течение 96 часов при температуре 26±10С, значении рН 5,0 и непрерывном перемешивании путем барботирования стерильным воздухом (расход воздуха 100 л/ч на 1л среды). Среду предварительно стерилизовали в автоклаве в течение 30 мин при 0,5 кгс/см2. В качестве питательной среды для глубинного культивирования использовали крахмало-аммонийную среду с содержанием крахмала 2% [4].

Посевным материалом служила глубинная культура Pleurotus pulmonarius , выращенная на лабораторном шейкере в колбах объемом 250 мл; количество вносимого инокулята составило 5 % от расчетного выхода абсолютно сухой биомассы. Выход биомассы определяли гравиметрическим методом. Полученный мицелий использовали для определения химического состава и содержания в нем биологически активных веществ.

Глубинную мицелиальную массу применяли также в качестве посевного инокулюма для твердофазного культивирования с целью получения плодовых тел Pleurotus pulmonarius . Ростовым субстратом служила солома, предварительно измельченная и простерилизованная в автоклаве в течение 1 ч при 0,5 кгс/см². Засев подготовленных субстратных блоков проводили в стерильных условиях, после чего осуществляли инкубирование при постоянной температуре 25±1^оС и влажности воздуха 60–65% до полного обрастания субстрата мицелием. Продолжительность инкубации зависела от нормы внесения посевного материала. После полной колонизации субстрата «белые блоки» помещали в помещение с температурой 18–20 ^оС для формирования плодовых тел.

Выделение чистой культуры, получение спорового отпечатка и спор проводили с использованием общепринятых микологических методов [4, 6, 8]. Микроморфологические особенности изучали с помощью светового микроскопа Olimpus SZX 41, а также с помощью электронно-растровой микроскопии (РЭМ-100У). Компьютерные изображения, полученные в процессе исследования, фиксировали с помощью цифровых камер Nikon PIX 4500 и Canon Power Shot A650IS.

Результаты и их обсуждение. Для точного определения систематической принадлежности исследуемого штамма базидиомицета необходимо совпадение морфологических признаков, присущих изучаемому плодовому телу или глубинному мицелию, с аналогичными признаками, описанными в литературе [2–5].

Плодовое тело Pleurotus pulmonarius состоит из шляпки и ножки. Шляпка неправильной полукруглой формы, у зрелого гриба приобретает ухообразную форму. Поверхность шляпки сухая, гладкая, окраска – белокремовая (рис.1, а). На нижней стороне шляпки находится гименофор пластинчатого строения. Пластинки редкие, толстые, белого цвета, нисходящие на ножку гриба. Тип пластинок: по строению края гименофора – гладкий; по взаиморасположению на гименофоре – разветвленный, с различной длиной пластинок (рис. 1,б). Ножка боковая, эксцентрическая, цилиндрическая, сужающаяся к низу, короткая, белая, плотная (см. рис. 1, а).

СибГТУ*Canon Power Shot A650IS*

а

Рис. 1. Плодовое тело Pleurotus pulmonarius, полученное путем твердофазного культивирования на растительном субстрате в лабораторных условиях

СибГТУ*Canon Power Shot A650IS* б

Кроме строения плодового тела, служащего абсолютно надежным критерием для видовой идентификации гриба, важными диагностическими признаками являются строение, окраска и размер базидиоспор. С этой целью из сформировавшегося и высушенного подового тела вешенки легочной в чашке Петри на контрастном черно-белом фоне был получен споровый отпечаток беловатого цвета (рис. 2, а). При дальнейшем микроскопическом исследовании было установлено, что поверхность спор гладкая, форма удлиненнояйцевидная, цвет белый, размер 7(9)х(3)4 мкм, что сопоставимо с литературными данными [5] (рис. 2, б).

СибГТУ*Canon Power Shot A650IS* а

СибГТУ*OlimpusCX41* б

Рис. 2. Макро- и микроморфологические особенности спорового материала Pleurotus pulmonarius: а – споровый отпечаток; б – споры

Для изучения макроморфологических особенностей чистую культуру Pleurotus pulmonarius, выделенную из плодового тела, выращивали на агаризованной среде в чашке Петри (рис. 3). В ходе радиального роста штамм сформировал колонию, характеризующуюся следующими признаками: форма округлая, цвет мато- во-белый, край ворсинчатый, профиль плоский, структура волокнистая, мицелий пушистый, с трудом отделяемый от субстрата, на поверхности колонии четко выражены радиальные кольца. Воздушный мицелий изучаемого штамма представляет собой систему разветвленных септированных гиф, на которых присутствуют одиночные пряжки, что является одним из отличительных признаков базидиальных грибов (рис. 4).

СибГТУ*Canon Power Shot A650IS*

Рис. 3. Морфология штамма Pleurotus pulmonarius при культи 20 м в м нии на сусловом агаре

На рисунке 4 приведены фотографии, отражающие микроморфологические особенности воздушного мицелия изучаемого штамма Pleurotus pulmonarius.

Рис. 4. Микроморфологические особенности воздушного мицелия штамма Pleurotus pulmonarius

Культуру, выращенную поверхностным способом, в дальнейшем использовали в качестве посевного материала для глубинного культивирования с предварительной стадией получения инокулята в колбах объемом 250 мл. В результате культивирования была получена биомасса молочно-белого цвета, состоящая из скопления многочисленных структур округлой формы, формирование которых зависело от степени и интенсивности перемешивания. Так, при мягком перемешивании путем барботирования образовывались сферические элементы с бахромчатым краем и плотным центром (рис. 5, а); при дополнительном механическом перемешивании отфильтрованная биомасса состояла из сферических элементов с гладкой поверхностью и плотным центром (рис. 5, б).

СибГТУ*Canon Power Shot A650IS* а

СибГТУ*Canon Power Shot A650IS* б

Рис. 5. Морфологические особенности Pleurotus pulmonarius при глубинном культивировании: а – с использованием барботирования; б – с использованием дополнительного механического перемешивания

Мицелий Pleurotus pulmonarius, полученный методом глубинного культивирования, характеризуется следующими микроморфологическими особенностями: гифы толщиной 3,0–5,0 мкм, бесцветные, разветвленные, септированные, с многочисленными одиночными пряжками (рис. 6).

100 мкм

СибГТУ*OlimpusCX41*

Рис.6. Микроморфологические особенности мицелия Pleurotus pulmonarius при глубинном культивировании

Биомассу, полученную методом глубинного культивирования, далее применяли в качестве посевного материала для получения плодовых тел на растительном субстрате. Сформировавшиеся плодовые тела, характерные для Pleurotus pulmonarius (см. рис.1) , подтверждают систематическую принадлежность исследуемого базидиомицета.

Таким образом, были исследованы макро- и микроморфологические особенности плодовых тел, спор и мицелия штамма Pleurotus pulmonarius в различных биотехнологических системах. Показано, что воздушный и глубинный мицелий имеют разветвленное гифальное строение; гифы септированы с одиночными пряжками. Мицелий, полученный методом глубинного культивирования, может быть использован как посевной материал для получения плодовых тел Pleurotus pulmonariu s путем твердофазной ферментации растительных субстратов.