Морфологические особенности тимуса крыс периода выраженных старческих изменений при иммуносупрессии, вызванной введением циклофосфамида

Введение. В настоящее время большой интерес представляет исследование особенностей реакции органов иммунной системы на воздействие различных экзогенных факторов. Одну из основных ролей в обеспечении приспособительных реакций организма на повреждающие факторы выполняет центральный орган иммунной системы – тимус [1]. Изменения строения органов иммунной системы зависят от интенсивности и продолжительности воздействия внешнего фактора.

В настоящее время для лечения аутоиммунных заболеваний, злокачественных опухолей, в трансплантологии возникает необходимость проведения иммуносупрессивной терапии [2], оказывающей негативное воздействие на различные органы и ткани, в частности на органы иммунной системы [3]. Циклофосфамид – цитостатический препарат, который широко применяется при лечении онкологических, аутоиммунных заболеваний, используется для профилактики отторжения трансплантатов [4, 5]. Вместе с тем он обладает большим количеством побочных эффектов, особенно в отношении клеток с высокой митотической активностью [6].

Однако на сегодняшний день, несмотря на то, что исследования ряда авторов посвящены изучению строения органов иммунной системы при действии различных иммуно-тропных препаратов [7, 8], данные о строении тимуса подопытных животных при экспериментальной иммуносупрессии представлены лишь в единичных публикациях [7, 9]. Кроме того, недостаточно изученными остаются адаптационные возможности тимуса в зависимости от возраста.

Цель исследования. Изучить морфологические особенности тимуса белых беспородных крыс-самцов периода выраженных старческих изменений в условиях экспериментальной иммуносупрессии, вызванной введением циклофосфамида.

Материалы и методы. Эксперимент выполнен в сертифицированной гистологической лаборатории кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии ГУ «Луганский государственный медицинский университет». Исследование проведено на 60 белых беспородных крысах-самцах периода выраженных старческих изменений (исходная масса 300– 330 г, возраст 20 мес.), полученных из вивария лабораторных животных университета. Иммуносупрессивное состояние у животных моделировали путём введения цитостатиче- ского препарата циклофосфамида. Использовали «Циклофосфан-КМП» («Cyclophospha-num-KMP») производства ОАО «Киевмед-препарат», серии П.07.02/05082. Препарат вводили животным в дозе, приводящей к иммунной депрессии (200 мг/кг массы тела животного), однократно внутримышечно на физиологическом растворе. Данная модель создания иммунодефицита широко апробирована при проведении иммунологических экспериментальных исследований [3, 6, 7]. Контролем служили крысы, получавшие 0,9 % раствор натрия хлорида в эквивалентном объёме. Выведение животных из эксперимента осуществляли через 1, 7, 15, 30 и 60 сут после введения препарата путем декапитации под эфирным наркозом [9]. Эксперимент выполнен с соблюдением правил биоэтики, утвержденных Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986), и одобрен комиссией по вопросам биоэтики ГУ «Луганский государственный медицинский университет» (протокол № 1 от 19.01.2013).

Объектом исследования служил тимус. Забор, фиксацию материала и изготовление парафиновых блоков выполняли согласно общепринятым методикам работы с лимфоидными органами [10]. Для изучения структурных компонентов тимуса парафиновые срезы толщиной 4–6 мкм окрашивали гематоксилин-эозином, для идентификации клеток использовали окраску азур-II-эозином [10].

Детали гистологического строения изучали с помощью аппаратно-программного комплекса, включающего микроскоп Olympus CX-41 и цифровой фотоаппарат Olympus SP 500UZ, с использованием компьютерной программы Morphology [11]. Определяли относительную площадь (в %), занимаемую субкапсулярной, внутренней кортикальной зонами коркового вещества и мозговым веществом долек. Кроме того, определяли плотность расположения клеток, в т.ч. лимфоцитов и эпителиоретикулоцитов, на стандартной площади (104 мкм2) морфофункциональных зон долек тимуса. Определяли процентное содержание клеточных элементов: лимфобластов, малых, средних и больших лимфо- цитов, макрофагов, митотически делящихся, деструктивно измененных клеток, эпителио-ретикулоцитов в морфофункциональных зонах тимуса. Производили подсчёт гистоструктур на шести полях зрения каждого среза, анализировали шесть срезов с каждого объекта.

Статистическую обработку данных проводили методом вариационной статистики с применением t-критерия Стьюдента. Результаты обработаны при помощи пакета программ Statistica 6.0. Достоверными считали данные с погрешностью менее 5 % (р<0,05, в тексте обозначено *).

Результаты и обсуждение. В тимусе белых крыс периода выраженных старческих изменений отмечаются естетственные признаки возрастной инфолюции, которая со- провождается структурной перестройкой органа и проявляется в постепенном уменьшении лимфоидной ткани и замещении ее соединительной и жировой. Морфометрическое исследование тимуса подтвердило данные, полученные с помощью световой микроскопии. Определение площадей сечения морфофункциональных зон тимуса крыс периода выраженных старческих изменений, а также сопоставление полученных данных с аналогичными показателями животных предыдущих возрастных групп [12] показали значительное снижение площадей коркового вещества по сравнению с аналогичными показателями более молодых животных (рис. 1). При этом площадь мозгового вещества возрастает.

Q Период полового созревания

^^^ Репродуктивный период

• □    Период выраженных старческих изменений

Рис. 1. Динамика изменения площади сечения коркового вещества тимических долек крыс различных возрастных периодов (M ± m, n=60) в контрольных группах

После введения циклофосфамида на протяжении всего периода наблюдения тимус животных репродуктивного периода сохраняет основные морфологические черты, характерные для белых крыс данного возрастного периода. Однако воздействие препарата приводит к выраженным изменениям строения железы на 1, 7, 15 и 30-е сут наблюдения. Дольки имеют небольшие размеры, разделяются перегородками, образованными тол- стыми прослойками соединительной ткани. Паренхима части долек замещена соединительнотканными структурами и жировой тканью, в массиве которой в виде островков расположена лимфоидная ткань. В сохраненных дольках отмечается сглаженность корково-мозговой границы. Мозговое вещество местами достигает субкапсулярной зоны, в нем наблюдается большое количество мелких тимических телец. Наиболее выраженные из- менения определяются через 1 и 7 сут после применения цитостатика. Через 2 мес. общегистологическая картина тимуса у крыс с введением циклофосфамида не имеет видимых отличий от таковой у животных контрольных групп.

С помощью морфометрического исследования установлены существенные изменения относительной площади субкапсулярной, внутренней кортикальной зон коркового вещества и мозгового вещества тимической паренхимы подопытных животных. Относительная площадь субкапсулярной и внутренней кортикальной зон уменьшается, а мозгового вещества увеличивается на 1, 7, 15 и 30-е сут после введения циклофосфамида (р<0,05) (рис. 2).

о о. О

СП

• □    Субкапсулярная зона % Внутренняя кортикальная зона ■ Мозговое вещество

Рис. 2. Динамика изменения площади сечения морфофункциональных зон тимуса крыс периода выраженных старческих изменений после введения циклофосфамида в разные сроки наблюдения (M±m, n=60)

Плотность расположения клеток в корковом и мозговом веществе долек тимуса животных, получавших циклофосфамид, снижается по сравнению с контролем. Так, в субкапсулярной зоне плотность расположения клеток уменьшается на 16,95*, 11,9*, 9,00* и 4,6 %* соответственно на 1, 7, 15 и 30-е сут наблюдения. Уменьшается также численность лимфоцитов (рис. 3).

Динамика общего количества клеток, лимфоцитов и эпителиоретикулоцитов на единице площади внутренней кортикальной зоны аналогична таковой в субкапсулярной зоне. Плотность расположения клеток подопытных животных на единице площади уменьшается 23,64*, 18,6* и 12,3 %* на 1, 7 и 15-е сут наблюдения соответственно. Плот- ность расположения лимфоцитов по сравнению с контролем снижена на 24,49*, 19,0* и 12,95 %* (рис. 3), эпителиоретикулоцитов – на 13,54*, 13,84* и 5,58 % в аналогичные сроки наблюдения.

В мозговом веществе на протяжении всего периода наблюдения выявляются отличия между показателями количества клеток на единице площади в экспериментальных и контрольных группах крыс. Они составляют 25,15 %* (1 сут), 13,5 %* (7 сут), 9,8 %* (15 сут), 6,2 %* (30 сут) и 4,6 %* (60 сут). Полученные результаты свидетельствуют об аналогичной динамике изменений количества лимфоцитов на площади 104 мкм2 (рис. 3).

После введения циклофосфамида наблюдается изменение цитоархитектоники мор- фофункциональных зон тимических долек подопытных животных. В субкапсулярной зоне в сравнении с контролем на 1–30-е сут после введения препарата отмечается снижение относительного содержания молодых форм лимфоцитов. Так, процентное содержание лимфобластов снижается на 18,75 %*

(1 сут), 24,76 %* (7 сут), 20,0 %* (15 сут) и 13,19 %* (30 сут). Отличия между показателями процентного содержания больших лимфоцитов подопытных и контрольных животных составляют 24,86*, 29,82*, 30,3, 15,82* и 18,06 %* соответственно на 1, 7, 15, 30 и 60-е сут наблюдения.

Рис. 3. Динамика плотности расположения лимфоцитов в морфофункциональных зонах тимуса крыс периода выраженных старческих изменений в контроле и после введения циклофосфамида в разные сроки наблюдения (M±m, n=60).

При этом содержание макрофагов повышается на 31,43 %* (1 сут), 47,06 %* (7 сут), 37,78 %* (15 сут) и 21,11 %* (30 сут). Содержание деструктивно измененных клеток возрастает по сравнению с контрольными данными на протяжении всего срока наблюдения. Митотически делящиеся клетки встречаются редко. Относительное содержание эпителиоретикулоцитов выше контрольных показателей на 38,27*, 45,6*, 48,85*, 41,93* и 23,2 %* на 1–60-е сут наблюдения.

Во внутренней кортикальной зоне отличия между показателями процентного содержания малых лимфоцитов подопытных и контрольных животных отмечаются на протяжении всего периода наблюдения и составляют 35,2 %* (1 сут), 28,6 %* (7 сут), 23,2 %* (15 сут), 12,19 %* (30 сут) и 5,5 %* (60 сут). Относительное содержание средних лимфоцитов на 17,38*, 11,45*, 8,28* и 8,17 %* снижено по сравнению с контролем на 1–30-е сут. В значительной степени превышает кон- трольные данные количество клеток с признаками деструкции, макрофагов, а также эпителиоретикулоцитов.

В мозговом веществе тимической паренхимы после введения цитостатика содержание малых лимфоцитов по сравнению с контрольными значениями уменьшается на 22,34*, 16,10*, 11,66*, 8,12* и 5,10 %* через 1, 7, 15, 30 и 60 сут наблюдения. Митотиче-ски делящиеся клетки встречаются редко. Относительное количество макрофагов на единице площади мозгового вещества увеличивается и составляет 20,00 %* (1 сут), 14,82 %* (7 сут), 13,11 %* (15 сут), 7,27 %* (30 сут) и 6,76 %* (60 сут). Повышено содержание деструктивно измененных клеток.

Полученные результаты могут свидетельствовать о высокой степени реактивности тимуса животных периода выраженных старческих изменений после иммуносупрессии, что проявляется изменением изученных морфометрических параметров по сравнению с контрольными данными. Подобная динамика морфологических изменений указывает на развитие акцидентальной инволюции тимуса, которая ускоряет инволютивные процессы.

Вероятно, имеет место токсическое влияние циклофосфамида на костный мозг, обусловливающее нарушение поступления клеток-предшественников в тимус и, как следствие, относительное уменьшение числа лимфоцитов, преимущественно молодых форм, а также увеличение относительного содержания макрофагов, деструктивно измененных и митотически делящихся клеток.

Кроме того, подобные изменения могут быть обусловлены подавлением пролиферативной активности лимфоцитов, массовым выбросом их в периферическое русло и частичным цитолитическим эффектом циклофосфамида.

Заключение. Введение циклофосфамида подопытным животным периода выраженных старческих изменений вызывает активную ответную реакцию тимуса. При этом характерно сочетание возрастной (замещение паренхимы органа жировой тканью, увеличение содержания соединительнотканных структур) и акцидентальной инволюции органа, проявляющейся делимфотизацией морфофункциональных зон тимической паренхимы. На 60-е сут после введения циклофосфамида происходит лишь частичное восстановление структуры органа..