Морфологическое и иммуногистохимическое исследование костного мозга при аутопересадке

Введение. В связи с ухудшающейся экологией, увеличением числа техногенных катастроф продолжается и рост онкологических заболеваний, что является актуальной проблемой онкогематологии. Следуя литературным данным [1,2,3], можно предположить, что некоторые онкогемато-логические заболевания связаны с нарушением обмена биогенных аминов в клетке, приводящим к возникновению патологических сдвигов в функционировании красного костного мозга. В последнее время в патогенезе онкологических заболеваний все большее значение придается морфологическим структурам, участвующим в местной регуляции тканевых процессов, а также биологически активным веществам, которые вырабатываются ими [4, 5].

Таким образом, изучение нейроаминного обмена костного мозга при аутопересадке даст возможность выявить структуры, участвующие во внутриклеточной регуляции функции костного мозга.

Цель исследования - выявление сопряжения между нейротрансмиттерными cтруктурно-функциональными единицами костного мозга при аутопересадке костного мозга во временном аспекте.

Материал и методы исследования. В эксперименте использовались мыши, разделенные на 2 группы: 1 - интактные мыши без введения (n=20); 2 - аутогенная пересадка костного мозга (n=20) - животным этой группы внутривенно вводили суспензию костного мозга, полученную от этой же мыши (аутотрансплантация). 0,1 мл костного мозга, взятый из бедренной кости мыши помещали в 1 мл физиологического раствора и тщательно размешивали. 1 мл суспензии костного мозга вводили в хвостовую вену этой же мыши. Число клеток в 1 мл суспензии было равно 2,1* 108.

Криостатные срезы костного мозга обрабатывались следующими методами: 1) метод Фалька–Хилларпа в модификации Е.М. Крохиной применялся для избирательного выявления катехоламинов и серотонина [7]; 2) метод Кросса, Эвена, Роста для выявления структур, содержащих гистамин [6]; 3) количественно концентрации катехоламинов, серотониа и гистамина в структурах костного мозга оценивались с помощью микроф-луориметрической насадки к люминесцентному микроскопу ФМЭЛ-6. Для определения серотонина использовался светофильтр № 8 с длиной волны 525 нм, для гистамина – № 7 с длиной волны 515 нм и для катехоламинов – фильтр № 6 с длиной волны 480 нм. Показания снимались с табло усилителя У-5 в условных единицах флюоресценции (у. е.); 4) определение серотонинового индекса (Is) использовалось для понятия особенностей распределения биогенных аминов в костном мозге. Is больше 1 свидетельствует о преобладании в клетке серотонина, а меньше 1 – о преобладании в клетке катехоламинов; 5) миелограмму рассчитывали на 500 клеток после окраски препаратов по Паппенгейму; 6) иммуногистохимический метод использовали для выявления пролиферации и апоптоза клеток, экспрессирующие белок p-53 в костном мозге.

Результаты исследования и их обсуждение. При изучении нейромедиаторного обмена после аутопересадки костного мозга учитывались исходные уровни биогенных аминов у интактных животных. Было выявлено, что через 40 мин в мазках костного мозга происходило увеличение числа гранулярных люминесцирующих клеток до 6 клеток (при норме 3-4), с повышенным содержанием катехоламинов и серотонина. В гранулярных люминесцирующих клетках нейроамины определялись не во всех гранулах. Моноамины диффундировали из гранул, вследствие чего наблюдалось увеличение люминесценции межклеточных пространств.

Кроме того, выявлялось незначительно уменьшенное число тучных клеток, с повышенным содержание всех аминов в них (табл. 1). Встречались дегранулированные тучные клетки.

Около островков размножения располагались нервные волокна, с рядом расположенными гранулярными люминесцирующими и тучными клетками. Выявлялись 2 вида лимфоцитов: с ярко люминесцирующими и тусклыми ядрами.

У юных и палочкоядерных нейтрофилов начинали слабо люминесцировать ядра. В цитоплазме мегакариоцитов увеличивалось содержание катехоламинов и серотонина. Повышалось число размножающихся бластных форм с увеличением в некоторых из них как катехоламинов, так и серотонина.

В мазках костного мозга опытных мышей наблюдалось диффузное свечение гистамина во всех гемопоэтических клетках костного мозга. Увеличивалось в 2 раза, по сравнению с интактными мышами, число гранулярных люминесцирую-щих клеток, с ярко - желтыми, разнокалиберными гранулами. Кроме того, большое содержание гистамина выявлялось в цитоплазме базофильных мегакариоцитов.

Отмечалась люминесценция мелких тучных клеток, с ассиметрично расположенными, как бы выпирающими, зелеными ядрами. Содержание гистамина в этих тучных клетках повысилось.

Через 2 часа после аутотрансплантации костного мозга гранулярные люминесцирующие клетки четко располагались около островков размножения, мегакариоцитов, по ходу нервных волокон. Их число не изменилось по сравнению с 40 минутным сроком, но увеличилось содержание катехоламинов и серотонина в отдельных гранулах. Увеличилось число однотипных слабо люминесцирующих круглых клеток, около которых в виде цепочки располагались гранулярные люми-несцирующие и, в меньшем числе, тучные клетки.

Тучные клетки отмечались мелкие, воз-

Таблица 1.

Содержание нейроаминов в биоаминосодержащих клетках костного мозга через 40 мин после аутотрансплантации костного мозга

Название клеток	Содержание нейроаминов, усл.ед.
	Катехоламины		Серотонин		Гистамин
	Интактные	Ауто-	Интактные	Ауто-	Интактные	Ауто-
Число ГЛК	15,6±0,1	18,1± 0,1	14,1± 0,1	19,2±0,2*	31,6±0,3	34,6±0,3
Число ТК	19,6±0,2	22,3±0,2	21,3±0,4	23,1±0,4	28,1±0,2	34,3±0,2*

Примечание: * - достоверно, даны среднеарифметические цифры; ± амплитуда колебания содержания веществ, р <0,05.

Таблица 2.

Внутриорганные корреляционные связи между нейроаминами и серотониновый индекс в гранулярных люминесцирующих и тучных клетках после аутотрансплантации костного мозга

Структуры	Взаимодействия	Сроки после аутотрансплантации
		Интактные	Через 40 мин	Через 2 часа
ГЛК	КА/СТ	-0,9	0,9	-0,3
	СТ/гистамин	0,4	0,6	0,8
	КА/гистамин	-0,5	0,53	0,4
	Серотониновый индекс	0,9	1,06	1,2
ТК	КА/СТ	0,9	0,97	0,7
	СТ/гистамин	0,8	0,7	0,9
	КА/гистамин	-0,7	0,65	0,5
	Серотониновый индекс	1,09	1,04	0,8

Примечание: красным цветом обозначены сильные положительные связи, синим – сильные отрицательные.

можно, что молодые, с меньшим содержанием катехоламинов и серотонина, по сравнению с интактными мышами.

Содержание гистамина увеличилось в основных биоаминсодержащих клетках, но наблюдалась усиленная дегрануляция тучных клеток, и раздробленность свечения некоторых гранулярных люминесцирующих клеток.

Выявлялись комплексы клеток, состоящие из гранулярных люминесцирующих, макрофагов, ретикулярных клеток и липоцитов, образующие тесный контакт между собой в центре кроветворных островков. Особенно часто такие контакты выявлялись в центре размножения и дифференцировки клеток эритроидного ростка.

При исследовании внутриорганных корреляционных связей через 40 мин после аутопересадки между нейроаминами в гранулярных люминесцирующих и тучных клетках выявляли сильные взаимодействия между катехоламинами/ серотонином.

Серотониновый индекс (Js) в гранулярных люминесцирующих и тучных клетках клетках стал выше единицы.

Через 2 часа после введение собственного костного мозга произошло резкое изменение взаимодействий между нейроаминами (табл. 2). В тучных клетках серотониновый индекс стал меньше единицы.

В миелограмме увеличилось как число лимфобластов с 11,1 до 13,8, так и бластных форм клеток с 2,1 до 3,6. Определялись митотически делящиеся лимфоциты. Усиливалась митотическая активность клеток, начиная с миелобластов.

При иммуногистохимическом исследовании в костном мозге позитивными на белок р-53 регистрировались тучные клетки, однако их число снижалось до 2 на одно поле зрения по сравнению с интактными мышами (рис.). Интенсивность окраски почти во всех структурах костного мозга снижалась. Слабо экспрессировали белок р 53 ядра клеток эритроидного ряда. Выявляемость позитивных мегакариоцитов на белок р 53 достигала до 1-2 клетки на одно поле зрения (у интактных мышей 3-4 клетки).

Анализируя данные экспериментального исследования можно заключить, что аутопересадка костного мозга увеличивает содержание нейроаминов в костном мозге. Наблюдается возникновение новых островков размножения, около которых начинают располагаться вновь образующиеся биоаминсодержащие изучаемые клетки. Выявлено регуляторное звено, состоящее из комплекса клеток - из гранулярных люминесцирующих, ретикулярной клетки, макрофага и липоцита, которые содержат все изучаемые нейроамины и участвуют в размножении, дифференцировке, старении и умирании клеток в костном мозге.

У опытных мышей лимфоциты выявлялись с ярко люминесцирующими и тусклыми ядрами. По данным Л.А. Любовцевой (1993), происходило образование как Т - , так и В-лимфоцитов, так как разные популяции лимфоцитов при их образовании имели разное содержание нейроаминов

Анализируя данные корреляционных связей в костном мозге выявлено нейромедиаторное взаимодействие и воздействие нейроаминов в тандеме как в гранулярных люминесцирующих, так и в тучных клетках. Серотониновый индекс (Js) через 40 мин в обеих структурах был выше

Рис. Срез костного мозга при аутопересадке: А. Гранулярные клетки; Б. Эндотелий сосуда;

В. Тучные клетки. Иммуногистохимическая реакция на маркер белка p-53. Ув. 400.

единицы. Это свидетельствовало о том, что в этом процессе серотонин является ведущим нейроамином. А так как, этот моноамин обладает супрессивными свойствами в отношении бластных форм клеток и способствует дифференцировке зрелых форм, то не контролируемого размножения не наблюдалось, а происходило увеличение процентного содержания зрелых форм клеток. Более того, повышение серотонинового индекса указывало на усиленное образование лимфоцитов супрессоров.

Через 2 часа после введение собственного костного мозга происходило резкое изменение взаимодействий между нейроаминами. В тучных клетках серотониновый индекс стал меньше единицы, что свидетельствовало о том, что процесс кроветворения усилиленно контролировался адренергическим звеном вегетативной нервной системы и со стороны деятельности тучных клеток.

Выводы:

• 1.    В костном мозге выявлены нейроаминпро-дуцирующие клетки, образующие комплексы из гранулярных люминесцирующих клеток, макрофагов, липоцитов и ретикулярных клеток. Данные клетки сопряжены друг с другом.

• 2.    При аутопересадке в костном мозге увеличилось число аминопродуцирующих клеток около вновь образующихся островков размножения. Аутопересадка костного мозга влияет на корреляционные связи между изучаемыми нейроаминами в гранулярных люминесцирующих и тучных клетках

• 3.    Аутотрансплантация костного мозга влияет на серотониновый индекс в нейроаминпродуци-рующих клетках, тем самым изменяя процессы митотической и супрессивной активности клеток костного мозга во временном аспекте.

• 4.    При аутопересадке костного мозга выявляется наибольшее число митотически делящихся клеток, что приводит к усиленному размножению клеток.

костного мозга, тем самым изменяя функциональную направленность миелоидной и лимфоидной ткани во временном аспекте.