Морфология внутренних органов и опухоли лабораторных крыс с перевитым раком печени РС-1 при пероральном введении флавоноидсодержащих экстрактов аврана лекарственного (Gratiola officinalis L.) и кукурузы антоциановой (Zea mays L.)

• ¹ Введение. Недостатками синтезируемых противоопухолевых препаратов являются их токсическое влияние на нормальные органы и ткани организма и развитие к ним устойчивости опухолей [1], что стимулирует поиск новых, более безопасных и высокоэффективных лекарственных средств. В настоящее время большое внимание стало уделяться нетоксичным или слаботоксичным препаратам растительного происхождения, которые могут быть использованы как для профилактики развития опухолевого процесса, так и для протекции нормальных клеток при проведении стандартного курса химио- и радиотерапии. В терапии онкологических заболеваний часто используются алкалоидсодержащие препараты растительного происхождения с достаточно хорошо изученными механизмами цитостатического действия [1–3]. Перспективным при создании противоопухолевых препаратов может оказаться комбинирование алкалоид- и флавоноидсодержащих экстрактов, так как флавоноидсодержащие компоненты, наряду с противоопухолевой и антиоксидантной активностью, способны защищать клеточные мембраны и снижать токсическое действие алкалоидсодержащих соединений [4].

Для исследования нами выбраны два растения: авран лекарственный, содержащий, по крайней мере, четыре флавоноида (апигенин, космосиин, аврозид и кверцетин) [4, 5], и антоциановая форма кукурузы обыкновенной, изначально созданная ге-

нетиками как источник стойкого антоцианового красителя [6–9], в которой обнаружены три антоциана: цианидин, хризантемин (3-О-β-D-гликопиранозоид цианидина), идеин (3-O-β-D-галактопиранозоид циа-нидина) и пять флавоноидов: трицин (5,7,4» — три-гидрокси-3»,5» — диметоксифлавон), кампферол (3,5,7,4» — тетрагидроксифлавонол), кверцетин (3,5,7,3»,4» — пентагидроксифлавонол), астрагалин (3-O-β-D-глюкопиранозоид кемпферола), изокверцетин (3-O-β-D- глюкопиранозоид кверцетина).

Цель исследования : в экспериментах in vivo исследовать противоопухолевую активность флавоноидсодержащих экстрактов кукурузы антоциановой и аврана лекарственного и их влияние на внутренние органы, опухоль и кровь лабораторных крыс с перевиваемым раком печени PC-1.

Материал и методы. Использованы отдельно водные растворы сухого спиртового экстракта аврана лекарственного ( Gratiola officinalis L.), собранного в экологически чистом районе на острове Волгоградского водохранилища выше Саратова, и сухого спиртового экстракта кукурузы антоциановой ( Zea mays L.). Сырье кукурузы антоциановой, выращенной в стандартных для данного вида условиях на территории Саратовской области, предоставлено сотрудниками кафедры генетики Саратовского государственного университета им. Н. Г. Чернышевского.

Экстракты были получены нами авторским способом (заявка на изобретение № 2012105384/15 (008220), положительное решение о выдаче патента от 7.02.2013 г.), позволяющим существенно повысить выход биофлавоноидов и предус- матривающим минимальный выход токсичных соединений (алкалоидов, гликозидов и др.) [4], что особенно актуально при получении нетоксичных экстрактов ядовитых растений, к которым относится авран лекарственный. Ранее в составе травы аврана была описана бетулиновая кислота, обладающая противоопухолевой активностью, но использованная нами технология получения экстракта исключала выход данного соединения. Химический анализ, проведенный нами на газовом хромато-масс-спектрометре Finnigan, позволил определить в полученном данным способом экстракте аврана следующие соединения: 4-винил-2-метоксифенол; 2,3-дигидро-3,5-дигидрокси-6-метил-4Н-пиран-4-он; 2,3-дигидробензофуран; 3-фуранкарбоновую кислоту; 5-гидроксиметил-2-фуральдегид; этил-a-d-рибозид; 4-пропилфенол; пирокатехин; L-луксоза (пентоза); 6-деоксигексоза L-галактозу; бензоилуксусной кислоты этиловый эфир; гексадекановую кислоту (пальмитиновая кислота); гомованилиновую кислоту; глюкозу; 1,4-ангидро-d-маннитол; бензойную кислоту; кверцетин. Экстракт кукурузы антоциановой, по данным газовой хромато-масс-спектрометрии [10], содержит: этиловый эфир гексадекановой кислоты; 5-гидроксиметил-2-фуральдегид; 1- (4-метоксифенил) — метоксипропан; 2,3-дигидро-3,5-дигидрокси-6-метил-4Н-пиран-4-он; гексадекановую кислоту (пальмитиновая кислота); этиловый эфир линоленовой кислоты; 9,12-октадекановую кислоту; 2- (5-хлор-2-метоксифенил) пиррол.

В эксперименте, проводимом в соответствии с руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ [11], использовано 30 самцов белых лабораторных крыс массой 150±50 г, которым имплантировали подкожно в области лопатки по 0,5 мл 25% опухолевой взвеси в растворе Хэнкса штамма альвеолярного рака печени РС-1, полученного из банка опухолевых штаммов ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН. Животные с перевиваемым раком методом случайной выборки были разделены на три группы по 10 крыс: первую опытную, получавшую экстракт аврана в дозировке 110,88 мг/кг, вторую опытную, получавшую экстракт кукурузы (637,58 мг/кг), и третью контрольную. В опытных группах крысам раствор вводили перорально один раз в двое суток в течение трех недель с момента трансплантации опухоли. После отмены введения экстракта наблюдения за животными продолжались еще неделю.

Динамику роста опухоли оценивали по изменению ее объема по формуле: V = А х В х С , где А — ширина, В — толщина, С — высота опухоли. Измерения проводили электронным штангенциркулем каждые два дня от начала эксперимента. На 26-е сутки крыс выводили из эксперимента и производили забор образцов ткани органов, опухоли, крови для исследований.

Для изучения патоморфоза опухоли и структурных изменений в органах применялись морфологические и морфометрические методы с использованием стандартных гистологических методик окраски гематоксилином и эозином, по Романовскому — Гимзе; гистохимические методики: PAS-реакция, окраска на лектин зародышей пшеницы (WGA), визуализация с помощью пероксидазы, а также окраска метиловым зеленым пиронином по Браше для выявления ДНК и РНК. Учитывали наличие дистрофических и некро-биотических изменений и такие цитоморфологиче-ские метрические показатели, как диаметр раковой клетки, соотношение диаметров раковой клетки и её ядра, ядерно-цитоплазматический индекс (ЯЦИ). Подсчет проводили на 100 клеток в 10 полях зрения каждого микропрепарата, с помощью микровизора медицинского проходящего света µVizo-101 (ЛОМО) [12, 13].

Антиоксидантную активность (АО) выявляли стандартными биохимическими методами с определением: малонового диальдегида (МДА) с помощью тиобарбитуровой кислоты, активности каталазы в эритроцитах, активности супероксиддисмутазы крови (СОД), показателя перикисного окисления липидов (ПОЛ) [14, 15]. Лейкоцитарную формулу крови анализировали по количеству палочек, сегментов, базофилов, моноцитов, лимфоцитов и индексу эндогенной интоксикации Каль-Калифа в модификации Б. А. Рейса и соавторов [16].

Работу с лабораторными животными осуществляли согласно протоколу исследований, не противоречащих Женевской конвенции 1985 г. о Международных принципах биомедицинских исследований с использованием животных. Тема и описания экспериментов одобрены этической комиссией ГБОУ ВПО «СГМУ им. В. И. Разумовского» Минздрава России (протокол № 13 от 3 мая 2011 г.).

Статистическую обработку результатов проводили в программе «SPSS 13.0» методами медикобиологической статистики с вычислением средней и стандартной ошибки средней. Значимость различий при параметрическом распределении определяли при помощи t-критерия Стьюдента для независимых выборок при Р<0,05.

Результаты. В группе крыс, получавших экстракт аврана, обнаружено замедление темпа роста опухоли через неделю на 2,5%, через две недели на 28% по сравнению с контролем, а через три недели достоверно на 41 %. Еще через неделю, к концу эксперимента, отмечалось замедление темпов уменьшения опухоли (на 15% по сравнению с контролем), что может быть обусловлено прекращением введения экстракта (рис. 1). В группе крыс, получавших экстракт кукурузы, выявлено, наоборот, увеличение объема опухоли через неделю на 61 %, достоверно через две недели на 115%, через три недели на 59% и к концу эксперимента на 22% по сравнению с контрольной группой (рис. 1).

Данные контрольной группы достоверно отличаются при Р<0, 05 на 14-й и 20-й день с группой, получавшей экстракт кукурузы, и на 20-й и 22-й день с группой, получавшей экстракт авран.

Перевиваемая опухоль в контроле микроскопически состояла из ячеек различной величины, разделенных тонкими прослойками соединительной ткани. Опухолевые клетки овально-округлой формы имели эксцентрично расположенные ядра. Значительная часть цитоплазмы занята крупными вакуолями, содержащими слизь. В одном и том же поле зрения можно было обнаружить клеточные элементы со слизистыми вакуолями различной величины. В клетках с небольшими эксцентричными вакуолями ядра чаще имели округлую или бобовидную форму. В клетках с крупными вакуолями в цитоплазме ядро было оттеснено к периферии, и такие клетки напоминали по своему строению перстневидные клетки слизистого рака. Выявлены единичные митозы. В небольших очагах некроза, наряду с фрагментами разрушенных клеток, обнаруживали скопления слизистых масс. Слизистые массы присутствовали также в межклеточных пространствах.

Рис. 1. Динамика роста опухоли в контрольной группе крыс и в группах крыс, получавших экстракты аврана и кукурузы

Рис. 2. Четкая зона некроза в раке печени РС-1 в группе животных, получавших экстракт аврана. Окраска гематоксилином и эозином (ув. 100)

Рис. 3. Гистологические изменения в опухоли по группам животных. PAS-реакция (ув. 400): А) в контроле, Б) в эксперименте с экстрактом аврана, В) в эксперименте с экстрактом кукурузы; WGA (ув. 400),: Г) в контроле, Д) в эксперименте с экстрактом аврана, Е) в эксперименте с экстрактом кукурузы; метиловый зеленый пиронин по Браше (ув. 100),: Ж) в контроле, З) в эксперименте с экстрактом аврана, И) в эксперименте с экстрактом кукурузы

В группе крыс, получавших экстракты как аврана, так и кукурузы, опухоль в целом сохраняла строение, описанное в контрольной группе. Однако, по сравнению с контролем, в опухоли крыс из группы, получавшей экстракт аврана, наблюдалось уменьшение количества слизистого компонента и развитие атрофических и дистрофических изменений опухолевых клеток, о чем свидетельствовало появление клеток по типу «клеток-теней»; в ткани опухоли обнаружено появление четких зон некроза и отсутствие митозов (рис. 2). В группе крыс, получавших экстракт кукурузы, в опухолевой ткани зоны некроза не имели четких границ.

При гистохимической окраске опухоли с помощью лектина зародышей пшеницы WGA (положительная визуализация пероксидазой, при взаимодействии WGA c гликопротеидами) и PAS-реакции (окраска на мукополисахариды) в группе крыс, получавших экстракт аврана, отмечали значительное снижение интенсивности окраски по сравнению с контролем, что свидетельствовало о повреждении поверхностных мембран клеток. В группе крыс, получавших экстракт кукурузы, как и в группе контроля, выявлено выраженное окрашивание опухолевой ткани (рис. 3).

При окраске на ДНК и РНК метиловым зеленым пиронином по Браше в опухоли крыс, получавших экстракт аврана, отмечено снижение количества клеток, в которых окраска на РНК была положительная и, следовательно, снижение транскрипционной активности в опухолевых клетках. Под действием экстракта кукурузы выявлено увеличение количества клеток с окрашенной РНК метиловым зеленым пиро-нином по сравнению с контрольной группой, что указывало, наоборот, на повышение транскрипционной активности в опухолевых клетках.

Следует отметить, что в группе крыс, получавших экстракт аврана, наиболее выраженный патоморфоз опухоли наблюдали в центральных ее отделах.

При морфометрическом исследовании диаметр ядер опухолевых клеток в группе крыс, получавших авран, составил 3,4±0,15, что на 13,5% меньше диаметра ядер клеток в контроле (4,05±0,15); в группе крыс, получавших экстракт кукурузы, диаметр ядер (4,07±0,15) достоверно не изменялся. Диаметр самих клеток (5,03±0,22) в группе крыс, получавших экстракт аврана, был достоверно меньше на 32,7%, по сравнению с диаметром клеток в контроле (7,45±0,15); в группе крыс, получавших экстракт кукурузы, диаметр клеток (5,9±0,15) был на 21 % меньше по сравнению с контролем (табл. 1). Значения показателя ЯЦИ под действием экстрактов увеличивались по сравнению с контролем. Снижение диаметра опухолевых клеток под действием экстракта аврана указывало на снижение их митотической активности, что также согласуется со снижением транскрипционной активности в автокаталитической интерфазе.

При гистологическом изучении органов животных, получавших экстракты, в головном мозге, сердце, легких, кишечнике, по сравнению с контролем, изменений не выявлено, и только в печени развивалась умеренная дистрофия гепатоцитов, более выраженная в группе крыс, получавших экстракт аврана, но данные изменения являлись обратимыми.

В лейкоцитарной формуле животных под действием экстрактов аврана и кукурузы по сравнению с контролем достоверно уменьшалось количество сегментоядерных нейтрофилов на 22,3% (под действием аврана) и 24,5% (под действием кукурузы) и увеличивалось количество лимфоцитов на 55% (под действием аврана) и 46% (под действием кукурузы) (табл. 2).

Таблица 1

Изменение метрических показателей клеток опухоли в контроле и под действием экстрактов

Показатели клеток опухоли	В контроле	Под действием экстрактов
		аврана	кукурузы
Размер ядра	4,05±0,04	3,40±0,04*	4,07±0,04
Размер клетки	7,45±0,04	5,03±0,05*	5,90±0,04*
ЯЦИ	0,54±0,008	0,68±0,008*	0,69±0,007*

П р и м еч а н и е : * — Р<0,001 достоверность различий при сравнении значений опытной и контрольной групп.

Таблица 2

Изменения лейкоцитарной формулы крови крыс в контрольной группе и группе, получавшей экстракты

Форменные элементы крови	В контроле (%)	Под действием экстрактов (%)
		кукурузы	аврана
Палочки	3±0,28	4,5±0,56*	3±0,21
Сегменты	60,3±1,09	45,5±0,56**	46,8±1,43**
Базофилы	1,67±0,33	3±0,3*	2,75±0,33
Моноциты	10,67±0,6	13,5±0,56*	10,4±3,44
Лимфоциты	24,67±0,44	36±0,37*	38,2±0,95**

П р и м еч а н и е : * — Р<0,05; ** — Р<0,001 достоверность различий при сравнении значений опытной и контрольной групп.

Таблица 3

Биохимические показатели крови (МДА, каталазы, и СОД) у крыс с перевитой опухолью под действием экстрактов аврана и кукурузы

Показатели	Группы животных
	контрольная	с экстрактом аврана	с экстрактом кукурузы
МДА, ммоль/л	1,933±0,14	5,248±1,3**	2,215±0,04**
Каталаза, МЕ	0,175±0,22	0,369±0,017*	0,114±0,008**
СОД, МЕ	4,527±0,28	7,188±1,46*	2,940±0,41*

П р и м еча н ие : * — Р<0,05; ** — Р<0,005 достоверность различий при сравнении значений опытной и контрольной групп.

Показатели эндогенной интоксикации

Таблица 4

Группы животных	ЛИИ	Степень интоксикации
Контрольная	2,58±0,2	Выраженная
С экстрактом аврана	1,02±0,12*	Умеренная
С экстрактом кукурузы	1,02±0,12*	Умеренная

П р и м еч а н и е : * — Р<0,05 достоверность различий при сравнении значений опытной и контрольной групп.

В эксперименте с экстрактом кукурузы показатель ПОЛ и АО ферментов не отличались от группы контроля (табл. 3), что свидетельствовало о слабой эффективности АО систем клеток при данном типе опухолей. В эксперименте с авраном наблюдалось повышение МДА на 171% относительно контроля, что свидетельствовало о разрушении эритроцитарных мембран под действием АФК, несмотря на то что активность ферментов также возросла: каталазы на 111%, СОД на 59% (табл. 3). Полученные данные свидетельствуют о высокой АО активности экстракта аврана.

При определении степени эндогенной интоксикации было установлено, что у животных в контрольной группе отмечалась высокая эндогенная интоксикация за счет развития опухолевого процесса, а под действием экстрактов уровень интоксикации снижался в 2,5 раза, соответствуя значениям умеренной интоксикации (табл. 4). Снижение уровня интоксикации, возможно, обусловлено наличием биофлавоноидов в обоих экстрактах.

Обсуждение. В группе крыс, получавших экстракт аврана, зафиксировано достоверное уменьшение диаметров опухолевых клеток и их ядер по сравнению c контролем. Не выявлено морфологических признаков потери дифференцировки и появления признаков атипизма клеток опухоли. Уменьшение размеров ядра и цитоплазмы раковых клеток, наряду с отсутствием митозов и низким содержанием в них РНК, указывает на низкую митотическую и транскрипционную активность клеток опухоли, и торможение клеточного цикла в период S- и G2-фаз с последующим резким снижением их пролиферации, что в целом свидетельствует о цитостатическом действии экстракта аврана. Данный эффект экстракта аврана подтверждается значительным замедлением темпов роста опу- холи, а также атрофическими и дистрофическими изменениями в опухолевых клетках, появлением в опухолях четких зон некроза по сравнению с контрольной группой.

Отсутствие выраженных изменений в органах крыс под действием экстракта аврана связано с его выраженной антиоксидантной активностью на фоне развивающейся опухоли, служащей защитным механизмом, снижающим токсическую нагрузку, и, наряду с увеличением количества лимфоцитов в крови, свидетельствует об общем благоприятном влиянии на организм животных, что характерно для флавоноидсодержащих экстрактов. Вместе с тем отсутствие выраженных изменений в органах крыс под действием экстракта свидетельствует о его избирательном цитотоксическом действии на клетки опухоли.

Появление некрозов в опухоли крыс, получавших экстракт кукурузы, может иметь другой генез, возможно связанный с недостаточным ростом сосудов, который не обеспечивает адекватного питания опухоли при ее выявленном более быстром и интенсивном по сравнению с контролем росте. Снижение значений цитометрических показателей раковых клеток под влиянием экстракта кукурузы наряду с отсутствием уменьшения размеров их ядер, возможно, происходит в результате высокой митотической активностью клеток, сопровождающейся также высокой транскрипционной активностью, о чем свидетельствует более высокое содержание РНК. Такие данные могут свидетельствовать об отсутствии включения механизмов торможения митотического цикла в клетках опухоли под действием данного экстракта кукурузы и даже о стимулирующем воздействии на рост исследуемого типа опухоли при пероральном введении. Вместе с тем уменьшение эндогенной интоксикации в целом на фоне растущей опухоли заслуживает особого дальнейшего исследования.

Заключение. Результаты нашего исследования позволяют сделать вывод о положительных эффектах экстракта аврана лекарственного на организм животных с перевиваемым раком печени и негативном воздействии на опухолевые клетки, проявляющемся в виде как цитотоксического, так и цитостатического эффектов, что открывает перспективу дальнейшего изучения приготовленного данным способом экстракта аврана в различных экспериментальных моделях. Приготовленный авторским способом экстракт сырья кукурузы, исследованный в настоящей работе, требует дальнейших экспериментальных исследований; он может быть перспективен при разработке препаратов, уменьшающих эндогенную интоксикацию, например при комплексной терапии онкологических заболеваний.