Морфометрическая и молекулярно-генетическая дифференциация линий и семей медоносной пчелы Apis mellifera caucasica L., разводимых в районе Большого Сочи

В представляемой работе мы показали, что структура генеалогиче- ского дерева, построенного по морфометрическим признакам, не отражала ни географическую общность происхождения, ни сходство в хозяйственно полезных признаках у изученных линий. Следовательно, для их адекватной характеристики и дифференциации необходимо сочетание морфометрических и молекулярно-генетических методов. Использованный нами комплексный подход позволит с высокой точностью определять не только породы пчел, но и более мелкие таксономические группы. Полученные результаты могут быть использованы в работе по восстановлению чистоты пород медоносных пчел.

Целью настоящей работы стала сравнительная оценка разнообразия и степени дифференциации линий Apis mellifera caucasica на основании данных морфометрического анализа и микросателлитов.

Методика. Исследования проводили в 2014 году. В качестве материала использовали рабочих пчел серой горной кавказской породы различных линий, разводимых на пяти пасеках в районе Большого Сочи (Краснодарский край): I — линия ¹ 19 (с. Медовеевка), II — линия ¹ 13 (ПГТ Красная Поляна), III — линия ¹ 12 (ПГТ Красная Поляна), IV — линия ¹ 49 (с. Калиновое Озеро) и V — линия ¹ 34 (с. Аибга). Для анализа отбирали 5 семей каждой линии по 22-30 пчел в семье (25 семей, n = 728), в том числе I — n = 149, II — n = 147, III — n = 147, IV — n = 137, V — n = 148. Пчел консервировали в 96 % спирте и хранили при +4 ° C.

Измеряли длину хоботка (ДХ, мм), ширину 3-го тергита (ШТ, мм) и рассчитывали кубитальный индекс (КИ) как отношение между большей и меньшей сторонами третьей кубитальной ячейки переднего крыла (8).

ДНК выделяли с помощью экстракции перхлоратом (28), материалом служила голова рабочей пчелы. Семь локусов микросателлитов (МС) — A024, A88, A113, AP043, HB-C16-05, HB-THE-03, HB-C16-01 амплифици-ровали в одной мультиплексной реакции с использованием флуоресцентно меченных праймеров. Реакции проводили в конечном объеме 15 мкл. В пробирки вносили по 14 мкл реакционной смеси (1 мкл 10½ ПЦР-буфера, 0,5 мкл 2 мМ раствора dNTPs, 0,7 мкл 100 мМ раствора DMSO, 4,6 мкл 10 мМ смеси праймеров, 0,1 мкл Таq-полимеразы, 7,1 мкл бидистиллиро-ванной воды) и добавляли 1 мкл (50-100 нг) исследуемой геномной ДНК. Состав ПЦР-буфера: 16,6 мМ (NH 4 ) 2 SO 4 , 67,7 мМ Трис-НС1 (рН = 8,8), 0,1 объема Tween 20. ПЦР выполняли в следующем режиме: начальная денатурация 8 мин при 94 ° С; отжиг 2 мин при 55 ° С; полимеризация 2 мин при 72 ° С; 30 циклов — денатурация 30 с 94 ° С, отжиг 35 с при 55 ° С, элонгация 40 с при 72 ° С; элонгация 20 мин при 72 ° С. Разделение продуктов ПЦР выполняли на генетическом анализаторе АВI3130xl («Applied Biosystems», США) с использованием внутреннего стандарта ROX. Электрофореграммы обрабатывали с помощью программного обеспечения GeneScan v. 3.7 и Genotyper v. 3.7 («Applied Biosystems», США).

Межсемейную изменчивость по морфометрическим показателям оценивали методом двухфакторного иерархического дисперсионного анализа с помощью программного обеспечения Statistica v. 6 (29). В качестве фиксированных эффектов использовали принадлежность к линии и семье (иерархический подчиненный фактор). Рассчитывали Mst:

F - 1

F - 1 + n ’

M st =

где F — дисперсионное отношение, n* — среднее геометрическое объема выборок. Величина M_st может принимать значения от 0 до 1 и оценивать меру морфологической дифференциации между отдельными популяциями и, по сути, представляет собой аналог F_st (30).

Генетические различия между семьями медоносной пчелы в отношении МС оценивали по показателю Fst (31) при парном сравнении и на основании генетических дистанций по M. Nei (32). Полученные попарные матрицы использовали для построения распределения центроидов семей в пространстве первых двух главных координат (PCA, principal component analysis). Для количественной оценки степени межсемейной изменчивости внутри линий рассчитывали идексы Fst, Rst (AMOVA) (33), используя программное обеспечение GenAlEx v. 6.5 (34).

Степень дифференциации пяти изучаемых линий A. m. caucasica по морфометрическим признакам оценивали посредством расчета евклидовых дистанций. Полученные значения использовали для построения дендрограммы подобия методом одиночной связи (single linkage) в алгоритме иерархической кластеризации (29). Оценку степени дифференциации линий по МС проводили на основании расчета значений генетических дистанций по M. Nei (32). Дендрограмму подобия строили методом UPGMA при помощи программного обеспечения PAST (v. 3.03). Дендрограмму проверяли на устойчивость топологии кластеров посредством проведения 999 перму-таций bootstrap-методом.

Результаты. При формировании каждая из изученных линий пчел была строго ориентирована на получение материала с заданными хозяйственно полезными признаками. Матки линии III обладают высокой яйценоскостью в период подготовки к основному медосбору, а семьи — повышенной продуктивностью по меду. Линии IV и V характеризуются ранним развитием по сравнению с линиями I, II и III. Пчелы линии IV менее зимостойки, в то время как линия II выделяется повышенной, а линия I — высокой зимостойкостью.

Были выявлены достоверные различия между линиями по двум из трех оцененных признаков — длине хоботка и ширине 3-го тергита, тогда как по значениям кубитального индекса различий между линиями мы не обнаружили (табл. 1). У пчел линии I по сравнению с другими изучаемыми линиями величина ДХ оказалась на 0,05-0,07 мм меньше (p < 0,001), а Ш3Т — на 0,04-0,11 мм больше (p < 0,001). Максимальную длину хоботка отмечали у пчел линии III. У пчел линий III и IV Ш3Т была на 0,08-0,11 мм меньше, чем у других линий (p < 0,001). Обнаруженные различия могут быть следствием разной стратегии при селекционно-племенной работе с этими линиями.

1. Морфометрические показатели у различных линий медоносных пчел серой горной кавказской породы ( Apis mellifera caucasica L.) ( X ± x , Краснодарский край, 2014)

Линия	Морфометрический признак
	ДХ, мм	1       Ш3Т, мм        1	КИ
I	6,88±0,006 a, b, c, d	4,72±0,010a, b, c, d	0,502±0,008
II	6,94±0,005b	4,67±0,010b, e, f	0,509±0,007
III	6,95±0,004c, i	4,64±0,008c, f, g	0,513±0,007
IV	6,94±0,004d, i	4,61±0,009d, e, h	0,515±0,008
V	6,93±0,005a	4,68±0,010a, g, h	0,524±0,008

П р и м еч а ни е. ДХ — длина хоботка, Ш3Т — ширина 3-го тергита, КИ — кубитальный индекс. Описание линий см. в разделе «Методика».

a, b, c, d, e, f, g, h p < 0,001, i p < 0,01 (достоверность различий между значениями, обозначенным одной и той же буквой).

Результаты двухфакторного иерархического дисперсионного анализа подтвердили наличие достоверных различий по признакам ДХ и Ш3Т как между линиями, так и между семьями в пределах каждой из линий.

Формирование кластеров по линейному принципу наблюдалось для трех из пяти исследованных линий (рис. 1). Только семьи линии I распре- делялись внутри одного обособленного 1-го кластера, однако они характеризовались наибольшей изменчивостью по показателю ДХ (CvДХ = 1,11 %) по сравнению с другими линиями (CvДХ = 0,69-0,86 %) при средней гетерогенности по Ш3Т (CvШ3Т = 2,49 %). Семьи линий III и IV формировали два консолидированных кластера (соответственно CvДХ 0,74 и 0,69 % и CvШ3Т 2,15 и 2,33 %), которые частично перекрывались между собой. У пчел линий II и V сильно варьировали оба признака (CvДХ — 0,79 и 0,86 %, CvШ3Т — 2,66 и 2,52 %). Достоверные различия (p < 0,05) между семьями внутри линий наблюдались по признаку ДХ в линии II (Mst = 0,1359) и признаку Ш3Т в линиях II (Mst = 0,2869) и V (Mst = 0,1525). Межлинейные раз- личия были достоверны (p < 0,05) для показателей ДХ (Mst = 0,1453) и Ш3Т

(Mst = 0,1097), в то время как по КИ достоверных различий мы не выявили.

Рис. 1. Распределение 25 семей медоносной пчелы серой горной кавказской породы ( Apis mellifera caucasica L.) в пространстве двух измерений по длине хоботка и ширине 3-го тергита: I-V — изучаемые линии медоносной пчелы; 1-3 — формирующиеся кластеры (Краснодарский край, 2014). Описание линий см. в разделе «Методика».

В целом следует отметить большую гетерогенность в отношении изучаемых признаков у пчел линий II и V и, напротив, большую консолидацию у пчел линий III и IV. Пчелы линии I существенно отличались от остальных по обоим показателям, однако характеризовались значительными межсемейны- ми различиями по ДХ.

Анализ МС профилей выявил сходные тенденции в определении степени внутрисемейной и межсемейной изменчивости (табл. 2).

В линии I (единственной из исследованных) наблюдался избыток гетерозигот (отрицательное значение Fis), что можно рассматривать как

2. Степень внутрисемейной и межсемейной (внутри линий) генетической изменчивости у медоносной пчелы серой горной кавказской породы ( Apis mellifera caucasica L.) по семи локусам микросателлитов (Краснодарский край, 2014)

Линия Показатели внутрисемейной и межсемейной изменчивости Fis Fit              1 Fst (freq) Rst (AMOVA) I -0,048 0,052 0,124 0,405 II 0,128 0,189 0,104 0,300 III 0,090 0,162 0,096 0,266 IV 0,062 0,143 0,095 0,141 V 0,077 0,169 0,102 0,462 I-V 0,132 0,162 0,040 0,094 П р и м еч а ни е. Расчеты проводили внутри каждой из линий с использованием семьи в качестве суб- популяции, а также для выборки в целом (I-V) с использованием линии в качестве субпопуляции. Описа- ние линий и локусов микросателлитов см. в разделе «Методика». указание на высокую гетерогенность. Пчелы этой линии характеризовались минимальной индивидуальной изменчивостью по отношению к выборке в целом (значение Fit было в 2,75-3,63 раза ниже по сравнению с линиями II-V) и максимальной межсемейной изменчивостью. У пчел линии II-V имелся дефицит гетерозигот (положительные значения индекса Fis), отмечалась относительно высокая индивидуальная изменчивость по 780

сравнению с выборкой в целом и более низкая по отношению к линии I межсемейная изменчивость. Наименьшие межсемейные различия, оцененные по показателям Fst и Rst (AMOVA), выявили в линиях III и IV.

Результаты PCA-анализа показали наибольшее сходство семей внутри линии IV, в то время как линии I и II характеризуются наибольшими межсемейными различиями (рис. 2).

□ □	• & де О А      О А
□ о + о      □	+ •    + • +

Координата 1

Рис. 2. Распределение центроидов семей медоносной пчелы серой горной кавказской породы ( Apis mellifera caucasica L.) в пространстве первых двух главных координат, рассчитанных на основе матрицы F_st при парном сравнении для семи локусов микросателлитов: — линия I, □ — линия II, + — линия III, А — линия IV, • — линия V (Краснодарский край, 2014). Описание линий см. в разделе «Методика». Расчеты проводили для выборки в целом с использованием семьи в качестве субпопуляции (число субпопуляций = 25).

Анализ дифференциации изучаемых линий выявил различия в структуре генеалогического дерева, построенного для семи локусов МС и трех морфометрических признаков (рис. 3). Дендрограмма, построенная по МС, отражала географическую удаленность изучаемых линий (см. рис. 3, А). Формирование двух главных кластеров могло быть следствием географической изолированности линий I, II и III, расположенных в окрестностях Красной Поляны (первая пасека находится на южном склоне хребта Ачи- шхо высотой 2391 м, вторая и третья расположены в ущелье реки Мзымта), от линии IV (пасека расположена на расстоянии 15-25 км от трех перечисленных и отделена от них хребтом Алек высотой 1000 м) и линии V (находится в верховьях реки Псоу, удалена от первой, второй и третьей пасек на 10-16 км и отделена от них хребтом Аибга высотой 2460 м). Существенные генетически различия между линиями IV и V могли быть обусловлены их географической изолированностью. Пасеки, на которых разводят эти линии, расположены на расстоянии около 30 км друг от друга и отделены хребтом Алек, который протянулся на 20 км между реками Мзымта и Сочи на расстоянии 15 км от берега Черного моря, и хребтом Аибга, протянувшимся с северо-запада на юго-восток на 23 км и разделяющим среднюю часть долины Мзымты и верховья Псоу.

Попарные генетические дистанции                     Евклидова дистанция

Рис. 3. Дендрограмма подобия пяти линий медоносной пчелы серой горной кавказской породы ( Apis mellifera caucasica L.), рассчитанная для семи локусов микросателлитов (А) и трех морфометрических признаков (Б) (Краснодарский край, 2014). Попарные генетические дистанции рассчитаны по M. Nei (32). В обоих случаях применен метод кластеризации UPGMA. Описание линий см. в разделе «Методика».

Структура генеалогического дерева, построенного по морфометри- ческим признакам, не отражала ни географическую общность (различия) происхождения, ни сходство (различия) в хозяйственно полезных признаках изучаемых линий.

Таким образом, нами обнаружены сходные тенденции при оценке внутрисемейной и внутрилинейной (между семьями) изменчивости на основе морфометрических показателей и микросателлитов. Однако данные о степени дифференциации и характере генеалогических связей между линиями, полученные с использованием двух систем анализа, существенно различались. Возможно, подобные расхождения обусловлены тем, что большинство различий по традиционным экстерьерным признакам (морфологические промеры) укладываются в пределы сезонных колебаний и малопригодны для идентификации локальных популяции. Кроме того, они в большей степени подвержены давлению отбора факторов внешней среды, не связанных с воздействием направленного искусственного отбора. Микросателлиты в большинстве случаев селекционно нейтральны и отражают более отдаленные эволюционные события. Следовательно, для получения наиболее полной информации о состоянии и динамике популяций необходимо учитывать результаты, полученные с использованием обоих методов.

Л И Т Е Р А Т У Р А

Sel’skokhozyaistvennaya biologiya [ Agricultural Biology ], 2015, V. 50, ¹ 6, pp. 776-784

MORPHOMETRIC AND MOLECULAR GENETIC DIFFERENTIATION OF Apis mellifera caucasica L. HONEY BEE LINES REARED IN SOCHI REGION

M.S. Fornara1, A.S. Kramarenko1, 2, S.V. Svistunov3, E.M. Lyubimov3,S.S. Sokol’skii3, N.A. Zinovieva1

Acknowledgements:

The equipment of Bioresources and Bioengineering Center of L.K. Ernst All-Russian Research Institute of Animal Husbandry was used.

Supported by the Russian Science Foundation, project 14-36-00039