Морфометрическая оценка особенностей влияния селимакцида на ультраструктурную организацию клеток Escherichia coli и Salmonella enteritidis

Введение. Исследования особенностей ультраструктуры Salmonella enteritidis и Escherichia coli имеют многолетнюю историю [1, 2]. Ученые изучали как нативное состояние энтеробактерий [3], так и влияние на них различных бактерицидных средств [4–6]. В научной литературе имеются сообщения о проявлении бактерицидной активности препарата селимакцид при желудочно-кишечных и респираторных заболеваниях [7, 8].

Поскольку электронная микроскопия позволяет визуализировать внутриклеточные структуры бактериальных клеток, на первом этапе была проведена общая оценка влияния сели-макцида на субмикроскопическую организацию сальмонелл и эшерихий; следующим этапом являлась количественная проверка выявленных качественных характеристик процесса [9].

Цель исследования – определить особенности воздействия селимакцида на ультраструктуру бактериальных клеток с помощью анализа морфометрических показателей и выявить релевантные количественные характеристики воздействия этого антимикробного препарата.

Задачи : рассчитать морфометрические характеристики как нативных бактерий, так и подвергавшихся воздействию селимакцида; провести статистическую обработку полученных данных; сделать выводы о значимости различных переменных для оценки влияния селимак-цида на ультраструктуры бактерий и факте наличия подобного влияния.

Материал и методы. Энтеропатогенные штаммы чистых культур Salmonella enteritidis и Escherichia coli термостатировали при температуре 37 °С в течение 24 ч на мясопептонном агаре. Через 1 сут бактериальные культуры суспензировали посредством изотонического раствора с целью достижения концентрации 2 миллиарда микробных клеток в 1 мл. Необходимую бактериальную концентрацию формировали, сравнивая по стандарту мутности бактериальных взвесей (комплект БАК) СОП № 1-98-15. Оба осадка культур, полученные при центрифугированиях с экспозициями по 15 мин (5000 об/мин), по одному разу промывали, используя физиологический раствор. С целью оценки антибактериального эффекта селимакцида в суспензии исходных штаммов вносили жидкую форму данного препарата в концентрации 20 мг/мл и через полчаса проводили центрифугирование, оба осадка промывали посредством изотонического раствора NaCl.

Электронно-микроскопические исследования выполнялись по отработанному нами методу получения ультратонких срезов [10]. Протокол подготовки образцов к исследованию представлен в таблице 1.

Для расчета морфометрических показателей (площади бактериальных клеток и их цитоплазмы) на микрофотографиях использовали программу FIJI–ImageJ [11]. Анализ результатов морфометрической обработки снимков проводили в программе Statistica 6.0 с использованием методов описательной и непараметрической статистики. Были вычислены такие показатели, как арифметическое среднее значение (M), его стандартное отклонение (Sd), а также минимальные и максимальные значения признаков. Для проверки статистических гипотез использовали непараметрический тест Манна – Уитни с поправкой на множественные сравнения по методу Бенджамини – Хохберга; результаты теста интерпретировали исходя из критического уровня значимости α = 0,05.

Таблица 1

Основные этапы подготовки материала для ультраструктурных исследований

Этап	Компонент
1	2
Фиксация	1 % раствор глутарового альдегида (Serva, ФРГ) на 0,1 М фосфатном буфере (рН = 7,4), при t = 4 °С, 12 ч
Промывка буфером	0,1 М фосфатным буфером (рН = 7,4) 2 раза по 10 мин
Фиксация	2 % тетраоксид осмия O S O 4 (Московский химзавод) на 0,1 М фосфатном буфере (рН = 7,4), при комнатной температуре, 2 ч
Промывка буфером	0,1 М фосфатным буфером (рН = 7,4) 2 раза по 10 мин

Окончание табл. 1

1	2
Дегидратация	Этиловые спирты восходящей концентрации – 30, 50, 70, 80, 96 % – 2 раза по 5 мин; абсолютные спирты 100 (I), 100 (II), 100 (III) – 2 раза по 10 мин каждый; ацетон – 2 раза по 10 мин
Пропитка заливочной средой	Ацетон + эпоновые смолы: •    смесь ацетон – смола (в частях 2:1) – 6 ч; •    смесь ацетон – смола (в частях 1:1) – 12 ч; •    смесь ацетон – смола (в частях 1:2) – 12 ч
Заливка в капсулы	Эпоновые смолы
Полимеризация	В термостате при t = 30 °С, t = 45 °С и t = 60 °С по 24 ч
Полутонкая резка	Микротом LKB-III 8800 (Швеция)
Ультратонкая резка	Микротом Reichert-Jung Ultracut-E 6524-01 (Австрия)
Контрастирование сеточек	Уранилацетат 2 % водный 2 ч при 37 °С, цитрат свинца 1,5 мин в присутствии щелочи
Просмотр срезов и съемка на фотопленку	Электронный микроскоп JEM 100 CX-II (Jeol, Japan); фототехническая пленка Agfa orthochromatic
Оцифровка снимков	Сканер Epson perfection 4990 foto с разрешением 600 dpi

Результаты и их обсуждение. Бактериальные клетки – Salmonella enteritidis и Escherichia coli на ультратонких срезах округлой или палочковидной формы. Электронограммы грамотри-цательных бактериальных клеток четко демонстрируют извилистую многослойную клеточную стенку, периплазматическое пространство и цитоплазматическую мембрану (рис. 1–4). Ультраструктура цитоплазмы нативных бактерий характеризуется высокой электронной плотностью с заполнением гранулярным компонентом – рибосомами, полирибосомами (см. рис. 1, 3). Область нуклеоида не всегда визуализируется. Нити ДНК распределены по цитоплазме.

Воздействие селимакцида не изменяет размеры бактериальных клеток Salmonella enteriti-dis и Escherichia coli , так, различия между группами контроля и опыта статистически не значимы (p = 0,15 для S. enteritidis и p = 0,71 для E. coli ). При этом у обеих исследуемых культур по периферии цитоплазмы наблюдалось уплотнение мелкогранулярного компонента цитоплазмы, а также просветление в центральной части клетки в области нуклеоида. Четко визуализируется расширение периплазматического пространства, чаще с дистальных сторон клеток, которое заполняется мелкогранулярным хлопьевидным содержимым средней электронной плотности (см. рис. 2, 4).

Для подтверждения наиболее выраженных визуальных признаков провели измерения общей площади бактериальных клеток (Sк) и их цитоплазмы (Sц), Sк/Sц – соотношение между площадью клеток и площадью их цитоплазмы (рис. 5).

Площадь клеток Salmonella еnteritidis уменьшилась под воздействием селимакцида на 15,4 %, а также на 22,2 % уменьшилась площадь цитоплазмы, что, вероятно, связано с нарушениями упаковки генетического материала и, соответственно, работы белоксинтезирующе-го комплекса. У Escherichia coli под воздействием селимакцида площадь клеток уменьшилась всего на 6,1 % при уменьшении площади цитоплазмы на 13,4 %. Тем не менее данные отличия статистически не значимы и могут быть отмечены лишь в качестве тенденции.

Увеличение периплазматического пространства и уплотнение цитоплазмы вокруг просветленного нуклеоида проявляются уменьшением соотношения площади цитоплазмы и всей клетки – на 7,5 % у S. enteritidis и на 6,8 % у E. coli . Данные различия статистически значимы; тем не менее в случае с E. coli данный эффект теряет статистическую значимость после введения поправки на множественные сравнения (что может быть связано с относительно небольшой величиной исследованной выборки и может быть в дальнейшем проверено на более обширном материале). Расширение периплазма-тического пространства клеток определяется как разность между общей площадью бактериальной клетки и площадью цитоплазмы (оно увеличивается на 67,9 % у S. enteritidis и на 166,7 % у E. coli ). Изменения периплазматиче-ского пространства клеточного барьера микроорганизмов, вероятно, связано с нарушениями структуры транспортных систем.

Рис. 1. Фрагмент среза нативной культуры Salmonella enteritidis: КС – клеточная стенка; ЦП – цитоплазма; В – включения цитоплазмы;

Г – гранулы на поверхности

Рис. 2. Фрагмент среза культуры Salmonella enteritidis после воздействия селимакцида: КС – клеточная стенка; ЦП – цитоплазма; ПП – периплазматическое пространство;

Рис. 3. Фрагмент среза нативной культуры Escherichia coli: КС – клеточная стенка; ЦП – цитоплазма

Н – нуклеоид

Рис. 4. Фрагмент среза культуры Escherichia coli после воздействия селимакцида:

КС – клеточная стенка; ЦП – цитоплазма;

ПП – периплазматическое пространство;

Н – нуклеоид

Рис. 5. Морфометрические показатели бактериальных клеток Salmonella enteritidis и Escherichia coli контрольной и опытной групп: Sк – общая площадь клетки, μм2; Sц – площадь цитоплазмы, μм2; Sк/Sц – соотношение между площадью клетки и площадью цитоплазмы; наличие статистически значимых отличий от группы контроля (p ≤ 0,05): a – без поправки на множественные сравнения; b – с поправкой на множественные сравнения

Полученные данные свидетельствуют о наличии деструктурирующего воздействия сели-макцида на бактериальные клетки Salmonella enteritidis и Escherichia coli .

Результаты данного исследования по особенности ультраструктурной организации бактериальных клеток на фоне влияния селимак-цида в целом по внешним признакам согласуются с данными других авторов.

Так, при воздействии ионов серебра на рост кишечной палочки [12] ультраструктура бактерий характеризовалась отделением клеточной стенки от клеточной мембраны. Авторы предполагают, что антибактериальный эффект приводит к нетипичному проявлению жизнедеятельности у E. coli , когда бактерии проявляют признаки физиологической активности, но у них прекращается рост (становятся некультивируе-мыми в средах).

В работе [13] экстракты растений Syzygium legatii и Eugenia zeyheri вызывали ультраструктур-ные повреждения клеток E. coli , характеризующиеся результатами (изменениями внешней и внутренней морфологии), внешне схожими с нашими: после трехчасового воздействия экстрактов S. legatii и E. zeyheri в дозе 0,04 мг/мл у сальмонелл отмечалось отделение клеточной стенки от мембраны и просветление цитоплазмы.

Клетки Escherichia coli , подвергшиеся воздействию антибиотика полимиксина В, имели набухшую оболочку с трубчатыми фимбриями и фимбриями, похожими на лучистые придатки [14]. Цитоплазма имела пониженную электронную плотность и была почти электроннопрозрачной. В группе, подвергшейся воздействию полимиксина В и миконазола, плазматическая мембрана отделялась от клеточной стенки. По мнению авторов, антибиотики изменяют проницаемость мембран и внутриклеточную рН.

В недавнем эксперименте [15] по оценке влияния гипохлорита натрия на ультраструктуру Salmonella enteritidis также показаны характерные смещения цитоплазматического содержимого, вплоть до разрывов клеточных стенок.

Заключение. Проведенное исследование воздействия селимакцида на ультраструктурную организацию Salmonella enteritidis и Escherichia coli показало, что наиболее релевантными признаками являются уменьшение объема цитоплазмы клеток (что выражается в уменьшении соотношения площадей цитоплазмы и всей клетки – на 7,5 % у S. enteritidis и на 6,8 % у E. coli); расширение периплазматического пространства, особенно на дистальных участках клеток, заполненного хлопьевидным веществом средней электронной плотности (на 67,9 % у S. enteritidis и на 166,7 % у E. coli).

По результатам исследования можно предположить, что селимакцид оказывает действие на упаковку или даже фрагментацию генетического материала, белоксинтезирующий комплекс и ионно-транспортные системы барьера клетки.