Морфометрические изменения нейронов префронтальной коры белых лабораторных крыс на фоне малобелковой пищи после острого звукового воздействия

Султанлы М.Э. Морфометрические изменения нейронов префронтальной коры белых лабораторных крыс на фоне малобелковой пищи после острого звукового воздействия. Морфологические ведомости. 2021;29(4):608. (4):608

Sultanly ME. Morphometric changes of prefrontal cortex neurons in white laboratory rats under conditions of the eating of the protein-deficiency food after acute sound stress. Morfologicheskie Vedomosti – Morphological Newsletter. 2021;29(4):608.   mn.2021.29(4):608

Введение. Префронтальная или лобно-орбитальная кора (далее - ПФК) представляет собой часть сложной интегративной функциональной системы, регулирующей память, когнитивные функции, поведенческие реакции у различных млекопитающих. Комплексно изучается роль ПФК в адаптации центральной нервной системы к стрессу [1-2]. Анализ литературы показывает, что недостаточно разработанными остаются вопросы восстановления нейронов ПФК после стресса в условиях дефицита белков в пище у млекопитающих. Это относится также и к белым лабораторным крысам – важнейшим объектам при моделировании различных патологических состояний. Практически не изучена динамика морфометрических показателей нейронов ПФК у крыс с малобелковым пищевым рационом после острого звукового стрессового раздражения.

Цель исследования. Целью настоящего исследования явился сравнительноморфометрический анализ нейронов префронтальной коры половозрелых белых лабораторных крыс в норме и в условиях питания сбалансированным и малобелковым пищевыми рационами после однократного острого звукового воздействия.

Материалы и методы исследования. Настоящее исследование выполнено на 64-х половозрелых нелинейных белых лабораторных крысах-самцах массой 180230 г. Из них 8 животных содержались в условиях вивария с достаточной шумо-изоляцией, адекватными освещением и вентиляцией, без ограничения приема пищи и воды, выводились из опытов параллельно животным контрольной и основной групп эксперимента и служили интактной группой для определения базисных показателей (условная «норма»). Остальные 56 крыс в специальной камере-клетке были подвержены непрерывному звуковому воздействию звонком интенсивностью 120 децибел (db) в течении 120 секунд. При подборе стрессового фактора–раздражителя были учтены данные о влиянии звукового воздействия на поведенческие реакции и способности крыс к адаптации [3]. Показателями неустойчи- вости к острому стрессорному воздействию послужили появление судорог у животных, избегание нахождения в освещенных участках клетки, минимизация количества пересеченных центральных квадратов в клетке, резкое увеличение продолжительности состояния неподвижности, уменьшение числа пищевых болюсов, уменьшение числа вертикальных стоек и вращательных движений головы, хаотичный и продолжительный груминг [1, 3]. По совокупности перечисленных параметров подопытные животные после звукового воздействия были разделены на «стресс-устойчивые» (24) и «стресс-неустойчивые» (32). Далее были сформированы 2 группы по 28 опытных животных в каждой (12 – стресс-устойчивые; 16 – стресс-неустойчивые): 1 - контрольная группа со сбалансированным пищевым рационом) и 2-я основная экспериментальная с малобелковым пищевым рационом. Животные контрольной группы с момента звукового воздействия до конца опытов (40-е сутки) вскармливались сбалансированной или богатой белками пищей по рецепту, предложенной Nikinorov et al. [4], включающей 20 г казеина, 65 г крахмала, 5 мл растительного масла, 5 г клетчатки (целлюлозы), 1 г комплекса витаминов и 0,4 г пищевой соли, без ограничения доступа к воде. В основной группе опытов в пищевом рационе 80,0% белка казеина или 16,0 г из 20,0 г на 100 г массы животного было заменено крахмалом и растительной клетчаткой. Таким образом, животные основной группы с момента звукового воздействия до конца опыта т.е. до 40-х суток, содержались на пище, обедненной белками. Как и у животных контрольной группы, ограничений в водном режиме у них не было.

Животные из эксперимента выводились внезапной массивной воздушной эмболизацией на 10-е, 20-е, 30-е и 40-е сутки после звукового воздействия. Сразу после выведения из опыта у животных извлекали префронтальные области обоих полушарий головного мозга. При уходе за животными и проведении экспериментов были соблюдены все принципы декларации Европейского Сообщества о животных (86/609/ЕЕС), используемых для экс- периментальных и других научных целей [5]. Руководствуясь атласами и стереотаксическими картами головного мозга белой лабораторной крысы [6], в каждом случае были обозначены 3 зоны ПФК с обеих сторон: медиальная, вентральная и латеральная. Вырезанные образцы ПФК были зафиксированы в 4,0% нейтральном формалине и растворе Карнуа, проведены через спирты восходящей концентрации, ксилола и заключены в парафин в аппарате для гистологической обработки тканей «Leica TP 1020». Для гистологического анализа часть серийных срезов толщиной 2,5-3,0 мкм из парафиновых блоков, изготовленных на микротоме «Microm HM 325 (Thermo Scientific)», была окрашена ге-матоксилином-эозином, пикрофуксино-вой смесью по van Gieson, 0,05% тионином, 0,1% толуидиновым синим, 0,1% метиленовым синим, а также – методом серебрения по Golgi [7]. Другая же часть срезов из тех же парафиновых блоков для верификации нейронов иммуногистохимически была обработана моноклональными антителами к нейро-специфической энолазе (neuro-specific enolase; NSE) и белкам нейрофиламентов (neurofilament protein; NFP) с выполнением процедур в автоматическом режиме (аппарат «VENTANA Bench Mark Ultra») с набором антител и средств визуализации «Roche Diagnostics».

Микроскопирование гистологических и иммуногистохимических препаратов было выполнено на микроскопе «Axio Scope A14» с фото-видеокамерой «Axiocam ERc5s» (Carl Zeiss). При интерпретации результатов гистологических окрашиваний и иммуногистохимических анализов руководствовались соответствующими стандартами [7-8]. Интенсивность хроматолиза в нейронах была оценена в условных единицах (у.е.) по 4-х балльной шкале: 0 - отсутствие; 1 у.е. – слабая, менее 25,0% площади цитоплазмы; 2 у.е. – средняя или 25-50% площади цитоплазмы; 3 у.е. – высокая, 50-75% площади цитоплазмы и 4 у.е. - очень высокая, более 75,0% площади цитоплазмы. В каждом из двух рассмотренных слоев (II-III) ПФК у каждого животного исследовали не менее 70 нейронов. Размеры и площадь нейрональных составных частей определялись с помощью программы «Morphology», адаптированной к камере «Axiocam ERc5s». Полученные цифровые данные были обработаны методами вариационной статистики с вычислением средней арифметической и ее средней ошибки (X±sx) при уровне доверительной вероятности p=0,95 и показателе точности (Csx) 5,0-11,0% [9].

Результаты исследования и их обсуждение. По цитоархитектонике кору префронтальной области интактных белых лабораторных крыс мы отнесли к «агранулярному» типу, с заметными колебаниями численности и топографии морфологических типов нейронов в различных зонах. Количественно преобладающими типами, по нашему мнению, являются пирамидные, звездчатые и корзинчатые нейроны, что согласуется также с выводами ряда других авторов [10-11]. Стоит отметить, что для уточнения клеточного состава и особенностей цитоархитектоники коры различных зон префронтальной области головного мозга белых лабораторных крыс необходимы дальнейшие комплексные исследования с применением более информативных методов иммуногистохимической верификации типов нейронов и трехмерной реконструкции взаимоотношений между ними. Установлено, что в контрольной группе у стресс-устойчивых животных со сбалансированным пищевым рационом к 10-м суткам после звукового воздействия цитоплазма уменьшается, а ядро, наоборот – увеличивается, что проявляется соответствующими изменениями их площади. Регистрируется низкой и средней интенсивности хроматолиз (фрагментация и частичный лизис) субстанции Ниссля в перикарионе нейронов, преимущественно – малых и средних пирамид во II-III слоях рассмотренных зон ПФК. Параллельно хроматолизу фиксируется также уменьшение площади ядрышек. В дальнейшем, на 20-40-е сутки после звукового воздействия наблюдается постепенная нормализация показателей площади цитоплазмы, ядра и ядрышек при еще остающихся морфологических и морфометрических проявлениях хроматолиза. Аналогичный характер изменений прослеживается также у стресс-неустойчивых животных со сбалансированным пищевом рационом. Но, в отличие от предыдущей подгруппы, интенсивность хроматолиза остается достаточно высокой к 40-м суткам опытов. Вместе с тем, статистический анализ показателей площади цитоплазмы, ядра и яд- рышек нейронов рассмотренных зон ПФК указывает на достоверную минимизацию их изменений, имевших место в 10-е и 20-е сутки после звукового воздействия (таблица 1).

Таблица 1

Динамика изменений некоторых количественных показателей нейронов II-III слоев префронтальной коры белых лабораторных крыс после звукового воздействия на фоне питания сбалансированной пищей (X±s x )