Морфометрические параметры эритроцитов серых тюленей

У морских млекопитающих имеются особенности строения и функционирования кроветворной системы, обусловленные длительной эволюцией в водной и полуводной среде. Одним из основных механизмов, определяющих продолжительность ныряния животных, является наличие запасов кислорода в теле (в крови и мышцах). Обеспечение газообмена в тканях напрямую зависит от физико-химических свойств плазмы и соотношения содержания форменных элементов в крови. Эритроциты, являющиеся главными переносчиками гемоглобина, под воздействием ряда физиологических факторов (изменение химического состава, ионного баланса, осмотического давления плазмы крови) способны быстро менять форму, размер и структуру, тем самым оказывая влияние на дыхательную функцию крови.

Описание морфометрических параметров эритроцитов крови морских млекопитающих представлено в небольшом числе исследований ( Володина и др., 2015; Кавцевич и др., 1996; Мисюра и др., 1997; Clark et al., 2002; Ronald et al., 1969 ). Особый интерес представляют механизмы развития кислородных запасов тела у щенков тюленей в период освоения ими водной среды (в поисках пищи и защиты от хищников).

Цель работы – проведение сравнительного анализа морфометрических параметров эритроцитов в периферической крови щенков серых тюленей в разные возрастные периоды и годы исследований.

Материалы и методы

Материал получен на щенных залежках в 2006 и 2013 гг. (о. Большой Айнов, Баренцево море). Для сравнения выбраны следующие возрастные группы щенков серых тюленей: 1 – новорожденные ( n = 14); 2 – питающиеся молоком (2–3 недели, n = 16); 3 – завершившие молочное вскармливание (1–1,5 месяцев, n = 18); 4 – самостоятельно питающиеся рыбой щенки (3–4 месяца, n = 6); 5 – взрослые животные (1 год, n = 4; 3,5 года, n = 2). Морфологию клеток изучали на мазках крови, окрашенных смесью Романовского – Гимзы, с помощью микроскопа Axio Imager M1, оснащенного программным обеспечением AxioVision (фирмы Zeiss). В каждом мазке измеряли не менее 500 эритроцитов. Определяли следующие морфометрические показатели эритроцитов: площадь и диаметр (величины, характеризующие размер клетки), неровность контура и форму-фактор (для оценки формы клетки), оптическую плотность (интенсивность окраски). Устанавливали наличие незрелых и патологических форм эритроцитов.

Результаты и обсуждение

Морфологический и морфометрический анализы эритроцитов крови позволили выявить ряд особенностей у щенков серых тюленей в разные возрастные периоды.

Форма эритроцитов

Во всех возрастных группах щенков серых тюленей преобладают нормальные (по форме) эритроциты – дискоциты, имеющие форму двояковогнутого диска, круглой формы, розового цвета, с равномерной окраской и небольшим просветлением в центре (рис. 1).

Рис. 1. Дискоциты серых тюленей

Fig. 1. Discocytes of grey seals

Живым организмам определенные (нормальные) размеры и правильная форма эритроцитов необходимы для прохождения через капилляры и осуществления газообмена в тканях. У человека даже в норме небольшая часть клеток может иметь форму, отличную от дисковидной. Отклонение формы и размеров эритроцитов от нормы используют в медицине для диагностики ряда заболеваний. При этом данные трансформации могут быть обратимыми и необратимыми ( Нагорнов и др., 2015 ).

Эхиноциты (шишковидная, ягодоподобная и зубчатая клетки) и стоматоциты (эритроциты, у которых центральное просветление имеет не округлую форму, а напоминает ротовое отверстие) относятся к обратимым формам (рис. 2), которые могут быть возвращены в нормальное состояние, остальные патологические формы эритроцитов являются необратимыми. Эхиноциты формируются при изменении кислотности среды от нейтральной до щелочной. У щенков серых тюленей данный тип клеток встречается с рождения (около 1 % эритроцитов) и возрастает до 2–5 % в группе питающихся рыбой.

Рис. 2. Обратимые формы эритроцитов (слева – эхиноцит, справа – стоматоциты) Fig. 2. Reversible forms of erythrocytes (left – echinocyte, right – stomatocytes)

Стоматоциты образуются под воздействием различных факторов: низкой pH, отсутствие витамина А. У тюленей обнаруживают единичные клетки.

Остальные формы эритроцитов являются необратимыми (рис. 3, 4).

Рис. 3. Необратимые формы эритроцитов (слева – кодоцит, справа – шизоциты) Fig. 3. Irreversible forms of erythrocytes (left – kodocyte, right – schizocytes)

У тюленей встречаются единичные кодоциты (мишеневидные клетки), увеличение их числа у человека является признаком железодефицитной анемии (рис. 3). Шизоциты – осколки разрушенных эритроцитов (рис. 3). Сфероциты имеют шаровидную форму, у них отсутствует центральное просветление (рис. 4), наблюдаются во всех группах щенков – около 1 %, у новорожденных их число доходит до 4 %.

Рис. 4. Необратимые формы эритроцитов – сфероциты

Fig. 4. Spherocytes – irreversible forms of erythrocytes

Вероятно, наличие данных видов эритроцитов не является патологическим нарушением, а присутствие в крови щенков тюленей незрелых форм (базофильный, полихроматофильный и оксифильный нормоциты) и молодых эритроцитов (ретикулоцитов) – физиологическая норма для бельков, связанная с активным формированием кроветворной системы (рис. 5, 6).

Общей закономерностью для настоящих тюленей является нахождение в их крови в раннем онтогенезе незрелых форм лейкоцитов и эритроцитов ( Кавцевич и др., 1996; Кавцевич, 2001; Кузин, 2008; Boily et al., 2006; ^eedham et al., 1980 ). Ядерные эритроциты (нормоциты) обнаруживаются в периферической крови щенков гренландского и серого тюленей, а также у взрослых особей гренландского тюленя.

Рис. 5. Нормоциты серых тюленей

(слева – базофильный, по центру – полихроматофильный, справа – оксифильный) Fig. 5. Normocytes of grey seals (left – basophilic, center – polychromatophilic, right – oxyphilic)

Рис. 6. Ретикулоциты серых тюленей Fig. 6. Reticulocytes of grey seals

Средние значения статистических показателей, характеризующих форму клетки, в частности округлость эритроцитов, незначительно меняются с возрастом животных. Увеличение числа эхиноцитов у новорожденных животных подтверждается снижением неровности контура у щенков серых тюленей следующих возрастных групп (табл.).

Таблица. Морфометрические параметры эритроцитов серых тюленей Table. Morphometric parameters of erythrocytes of grey seals

Возрастная группа	Год исследования	Площадь, 2 мкм	Диаметр, мкм	Оптическая плотность, у. е.	Форма-фактор, у. е.	Неровность контура, у. е.
Новорожденные, 0–1 нед.	2006	51,70 ± 1,83	8,03 ± 0,20	0,150 ± 0,002	0,855 ± 0,010	1,79 ± 0,04
	2013	55,02 ± 1,24	8,34 ± 0,10	0,152 ± 0,012	0,904 ± 0,004	1,87 ± 0,04
Питающиеся молоком, 2–3 нед.	2006	48,60 ± 1,25	7,82 ± 0,10	0,195 ± 0,015	0,861 ± 0,011	1,74 ± 0,02
	2013	52,12 ± 0,48	8,12 ± 0,04	0,155 ± 0,007	0,900 ± 0,006	1,84 ± 0,01
Завершившие молочное вскармливание, 1–1,5 мес.	2006	45,56 ± 0,80	7,59 ± 0,07	0,156 ± 0,006	0,865 ± 0,003	1,68 ± 0,02
	2013	49,19 ± 0,70	7,90 ± 0,06	0,149 ± 0,001	0,885 ± 0,001	1,77 ± 0,01
Самостоятельно питающиеся рыбой щенки, 3–4 мес.	2006	47,16 ± 0,99	7,73 ± 0,08	0,086 ± 0,009	0,817 ± 0,008	1,66 ± 0,02
Взрослые	2003	44,53 ± 0,18	7,51 ± 0,01	0,155 ± 0,038	0,855 ± 0,003	1,65 ± 0,01

Размер эритроцитов

В норме клеточный состав крови человека содержит 70 % нормоцитов и по 15 % составляют микро- и макроциты. Существенные изменения размеров эритроцитов наблюдаются в группах бельков серых тюленей. Для них характерно преобладание макроцитов до 60 %. Щенки, исследованные в 2013 г., в целом отличаются более крупными эритроцитами по сравнению с аналогичными возрастными группами животных в предыдущие годы (рис. 7, табл.). Возрастание количества макроцитов, вероятно, обеспечивается присутствием в крови данных групп щенков большого числа сфероцитов, имеющих больший размер (площадь и диаметр) по сравнению с дискоцитами. Следует отметить, что макроцитоз как физиологическое явление наблюдается у новорожденных (человека) в течение первых 2 недель жизни и исчезает к 2-месячному возрасту.

■ Мегалоцит

Макроцит

■ Нормоцит

■ Мп кропит

Возрастные группы

Рис. 7. Соотношение эритроцитов серых тюленей Fig. 7. Ratio of erythrocytes of grey seals

Окраска эритроцитов

Известно, что у новорожденных водных млекопитающих наблюдается высокое содержание эритроцитов в крови и концентрация в них гемоглобина по сравнению со взрослыми животными. На следующих возрастных этапах, когда животные набирают вес и начинают регулярно погружаться под воду для добывания корма, число эритроцитов снижается. При этом с возрастом увеличивается среднее содержание гемоглобина в эритроците и средний объем эритроцита, что обеспечивает необходимые кислородные запасы ( Burns et al., 2007; Koopman et al., 1995; Shirai et al., 1997; Yochem et al., 2008 ).

Считается, что по интенсивности окраски можно судить о степени насыщенности эритроцитов гемоглобином. Щенки тюленей в возрасте 3–4 месяцев отличаются самыми низкими значениями данного цветохимического показателя (рис. 8). Вероятно, в период голодания после ювенильной линьки синтез гемоглобина и других белков был снижен, при переходе тюленей к подводному плаванию (в поисках пищи) его накоплено недостаточно для длительной задержки дыхания во время ныряния. Показатели оптической плотности эритроцитов говорят о низком содержании гемоглобина в клетке. Известно, что кислородные запасы в крови и мышцах взрослых животных (у гренландских тюленей и тюленя-хохлача) достоверно выше, чем у щенков ( Burns et al., 2007 ).

В группах щенков серого тюленя до 2–3-недельного возраста, изученных в 2013 г., выявлено отсутствие корреляционной зависимости интенсивности окрашивания эритроцитов и содержания в клетках гемоглобина. Скорее всего, это связано с повышением в крови у бельков нормоцитов, ретикулоцитов (обедненных гемоглобином, но при этом интенсивно окрашенных) и эритроцитов с измененными (патологическими) формами: эхиноцитов и сфероцитов. Известно, что дефицит гемоглобина в клетке приводит к уменьшению ее объема и, соответственно, к уплощению. От деформации эритроцит становится более плоским, тонким и жестким, а диаметр его возрастает. Как результат, эритроцит хуже проходит сквозь капилляры и повреждается, а от чрезмерного сжатия в его оболочке возникают большие касательные и растягивающие напряжения, расслаивающие и даже разрывающие ее по экватору, где больше натяжение.

Разрывы превращают эритроцит в звездчатый ( Семиков, 2005 ). Таким образом, цветохимический показатель эхиноцитов и сфероцитов незначительно отличается от такового у дискоцитов, при этом различия в содержании гемоглобина в данных типах клеток существенны.

< 1 нед. 2-3 нед. 1-1.5 мес.

Возрастные группы

Рис. 8. Показатели оптической плотности эритроцитов серых тюленей Fig. 8. Optical density indicators of red blood cells of grey seals

У щенков серых тюленей в возрасте 1–1,5 месяцев коэффициент корреляции между показателями оптической плотности и содержанием гемоглобина в эритроцитах составляет 0,88.

Таким образом, во всех возрастных группах серых тюленей преобладают "нормальные" (по форме) эритроциты – дискоциты. В первые недели жизни у щенков наблюдается макроцитоз и сфероцитоз, встречаются ядерные эритроциты и ретикулоциты, что вероятно, является физиологической нормой, связанной с активным формированием у них кроветворной системы. У щенков тюленей в возрасте 3–4 месяцев в связи с переходом их к подводному плаванию наблюдается низкая степень насыщенности эритроцитов гемоглобином, что подтверждает снижение у них запасов кислорода в крови.

Заключение

В результате проведенных исследований получены морфологические и морфометрические характеристики эритроцитов серых тюленей в раннем периоде постнатального развития. Присутствие в крови, наряду с преобладающими нормальными клетками, обратимых (эхиноциты, стоматоциты) и необратимых (кодоциты, шизоциты, сфероциты) форм, незрелых и молодых эритроцитов свидетельствует об активном формировании кроветворной системы в этот период.

У обследованных особей отмечены достоверно близкие эритроцитарные показатели крови в 2006 и 2013 гг. исследований. Выявлено, что с возрастом животных изменяются размеры и форма эритроцитов, данный факт говорит о физиологических и индивидуальных особенностях щенков тюленей. Таким образом, показатели оптической плотности окрашенных клеток могут применяться для сравнительной оценки по содержанию гемоглобина в эритроцитах между разными группами и видами морских млекопитающих.