Мутационный профиль КRAS-позитивного колоректального рака

Колоректальный рак (КРР), по данным ВОЗ, занимает третье место в структуре онкологических заболеваний, являясь одной из наиболее частых причин смерти [1, 2]. Отмечается неуклонный рост заболеваемости КРР, которая в ближайшем десятилетии может значительно возрасти, в том числе и среди молодых людей [3, 4]. Повысить эффективность лечения и улучшить показатели выживаемости при КРР позволяет внедрение новых высокотехнологичных методов лечения, включая таргетную терапию.

В основе патогенеза КРР лежит взаимодействие экологических и генетических факторов. Известно большое количество молекулярно-генетических маркеров, которые участвуют в развитии КРР, определяя клиническую картину заболевания [5]. Пациенты со схожими гистологическими типами опухоли часто имеют различные прогностические перспективы, что может быть связано с молекулярно-генетическими особенностями опухоли, лежащими в основе канцерогенеза [5, 6]. Информация о молекулярном разнообразии опухоли при КРР помогает не только совершенствовать диагностику, но и разрабатывать новые подходы к эффективной персонифицированной терапии [7].

В настоящее время лишь несколько генетических маркеров, участвующих в процессах малигнизации и опухолевой прогрессии, нашли применение в клинической практике. Основные рекомендации по лечению пациентов с КРР предполагают определение мутационного статуса генов семейства RAS и гена BRAF. Мутации, выявляемые в генах семейства RAS, являются валидированными показателями резистентности к анти-EGFR-таргетной терапии. Что касается мутаций в гене BRAF, то имеющиеся в литературе данные не однозначны и в основном свидетельствуют об очень ограниченной пользе ингибиторов EGFR при лечении КРР [8]. Несмотря на тестирование мута- ционного статуса генов семейства RAS, число чувствительных к таргетной терапии пациентов пока невелико. Примерно в 35–40 % случаев при КРР выявляются активирующие мутации в гене KRAS, которые не позволяют назначать анти-EGFR-таргетную терапию [9]. Кроме того, эффективность анти-EGFR-таргетной терапии у пациентов с диким типом гена KRAS часто снижается из-за развития вторичной резистентности в процессе лечения. Неудивительно, что предметом все возрастающего числа исследований является поиск новых мишеней для лечения КРР [8, 10–13].

Благодаря применению нового высокочувствительного метода секвенирования нового поколения (NGS) были выявлены многочисленные молекулярно-генетические изменения (мутации, транслокации и амплификации), которые лежат в основе развития КРР и определяют высокую пластичность и устойчивость клеток опухоли к лекарственным препаратам и лучевой терапии. До недавнего времени персонифицированная медицина, основанная на индивидуальном секвенировании генома, была дорогостоящей и трудоемкой. Постоянное усовершенствование технологии NGS, ее активное внедрение в практическую медицину, благодаря реальной возможности проведения анализа десятков и сотен генов в одном исследовании, позволяют зачастую заменить ряд рутинных молекулярно-генетических методов, в частности метод полимеразной цепной реакции и метод секвенирования по Сенгеру.

Целью исследования явилось изучение особенностей молекулярно-генетического профиля KRAS -позитивного КРР.

Материал и методы

В исследование были включены 42 пациента в возрасте от 48 до 86 лет (средний возраст – 67,7 ± 8,8 года) с диагнозом колоректальный рак, из них 17 женщин и 25 мужчин. У 27 больных опухоль располагалась в ободочной кишке, у 15 – в прямой кишке. Диагноз верифицирован инструментально и морфологически. Гистологическую классификацию опухоли и стадирование заболевания проводили согласно системе TNM (7 издание, 2010). Распределение по стадиям заболевания: I стадия – 11, II – 9, III – 10, IV – 12 пациентов. Во всех случаях была аденокарцинома различной степени дифференцировки: низкодифференцированная – 3, умереннодифференцированная – 24, высокодифференцированная – 15. Все пациенты проходили хирургическое лечение в Российском научном центре рентгенорадиологии МЗ РФ в период с 2014 по 2019 г. Неоадъювантное лечение не проводилось. У всех пациентов в опухолевой ткани, полученной после операции, методом ПЦР в режиме «реального времени» были выявлены мутации в гене KRAS. Представленная работа одобрена этическим комитетом Российского научного центра рентгенорадиологии МЗ РФ (протокол № 3, от 17 марта 2014 г.). Все пациенты подписали письменное информированное согласие на участие в исследовании.

ДНК выделяли из операционного материала, хранящегося в формалин-фиксированных парафиновых блоках (FFPE) и содержащего не менее 60 % опухолевых клеток. Для выделения ДНК использовали коммерческие наборы DNA FFPE kit («Qiagen», США). Концентрацию ДНК измеряли флуоресцентным методом с использованием наборов Qubit dsDNA HS Assay kit («Invitrogen») на приборе Qubit («Invitrogen»). Концентрация двухцепочечной ДНК каждого образца составляла не менее 5 нг/мкл. Качество ДНК перед пробо-подготовкой библиотек оценивали методом ПЦР в режиме «реального времени» с использованием наборов GeneRead DNA QuantiMize («Qiagen», США) на приборе 7500 real-time PCR systems («Applied Biosystems», США) с последующей обработкой полученных данных с помощью программного обеспечения GeneRead DNA QuantiMize 96 DataAnalysis.

Пробоподготовку библиотек из выделенной ДНК для последующего анализа методом NGS проводили с использованием коммерческих наборов GeneRead DNASeq Targeted Panel v2 Human Colorectal Cancer («Qiagen», США); NEBNext Ultra DNA library Prep kit for Illumina и NEBNext Multiplex Oligos for Illumina («New England BioLabs») в соответствии с рекомендациями производителя. Таргетная панель «GeneRead DNASeq Targeted Panel v2 Human Colorectal Cancer» включала следующие гены, участвующие в молекулярном патогенезе КРР: KRAS, BRAF, NRAS, APC, TP53, SMAD2, SMAD4, FBXW7, PIK3CA, CTNNB1, TCF7L2, MLH1, MSH2, MSH3, MSH6, ATM, TGF-BR2, AKT1, CDC27, CASP8, MAP2K4, DCC, DMD, MAP7, ERBB2, P3H3, MIER3, CADM1, FLT4, PTPN12, PIK3R1, EP300.

Готовые библиотеки ДНК разводили до концентрации 4 nM, смешивали в эквимолярных количествах и затем подвергали кластеризации с использованием стандартной проточной ячейки. Секвенирование осуществляли на платформе MiSeq (Illumina, США) с использованием набора реагентов MiSeq v2 (300 циклов).

Биоинформатический анализ данных – получение VCF файлов (variant call format) из файлов формата FASTQ – проводили с использованием программного обеспечения MiSeq Reporter (Illumina, США), которое позволяло картировать и выравнивать отсеквенированные таргетные последовательности на референсную последовательность генома человека (GRCH37/hg19).

Для аннотирования и интерпретации генетических вариантов использовали программное обеспечение Variant Studio 2.0 (Illumina), которое работает с VCF файлами. Для исключения артефактных и некачественных нуклеотидных вариантов были установлены следующие параметры фильтрации: глубина прочтения составляла не менее ×100, глубина прочтения альтернативного варианта – не менее ×10. Для исследования выбраны генетические варианты, соответствующие параметрам фильтрации. Все соматические мутации, найденные в образцах ДНК ткани опухоли, были подтверждены методом прямого секвенирования по Сенгеру.

Генетические варианты были аннотированы и интерпретированы с использованием базы данных однонуклеотидных полиморфизмов (dbSNP), баз данных COSMIC, cBioPortal и других. Для визуализации генетических вариантов применяли программу IGV (Integrative Genomics Viewer), в которой прочитанные таргетные участки ДНК выравниваются на референсный геном человека (GRCH37/hg19).

Результаты

Помимо мутаций в гене KRAS, которые предварительно были выявлены методом ПЦР в режиме «реального времени» у всех 42 обследованных пациентов , изменения в других генах обнаружены у 36 человек. Всего было выявлено 82 соматические мутации в 13 генах (табл. 1).

В генах NRAS, BRAF, MLH1, MSH2, MSH3, MSH6, TGF-BR2 , MAP2K4, AKT1, CDC27, CASP8, ERBB2, P3H3, CADM1, MIER3, EP300, PTPN12, FLT4 соматические мутации не были обнаружены ни у одного обследованного пациента. Самое большое количество соматических мутаций было выявлено в генах APC – у 25 (59,5 %) и TP53 – у 23 (54,7 %) пациентов.

Мутации в гене АРС выявлены у 25 человек, при этом около 70 % всех изменений, обнаруженных в гене APC, являются нонсенс-мутациями, приводящими к образованию преждевременного стоп-кодона и в дальнейшем к образованию укороченного белка (табл. 2). Реже встретились таблица 1/table 1

спектр и частота мутаций, выявленных в обследованной группе больных spectrum and frequency of mutations detected in the examined group of patients

Ген/Gene Число мутаций/ Number of mutations Число пациентов с мутациями/ Number of patients with mutations APC 29 (35,4 %) 25 (59,5 %) TP53 23 (28,0 %) 23 (54,7 %) FBXW7 8 (9,8 %) 7 (16,7 %) SMAD4 3 (3,7 %) 3 (7,1 %) SMAD2 3 (3,7 %) 3 (7,1 %) ATM 3 (3,7 %) 2 (4,8 %) PIK3CA 3 (3,7 %) 3 (7,1 %) DMD 3 (3,7 %) 3 (7,1 %) CTNNB1 2 (2,4 %) 2 (4,8 %) TCF7L2 2 (2,4 %) 2 (4,8 %) DCC 1 (1,2 %) 1 (2,4 %) MAP7 1 (1,2 %) 1 (2,4 %) PIK3R1 1 (1,2 %) 1 (2,2 %) изменения, представленные инделами со сдвигом рамки считывания: в 5 образцах ДНК опухолевой ткани обнаружены делеции со сдвигом рамки считывания, в 2 образцах – инсерции со сдвигом рамки считывания. В одном образце ДНК выявлена миссенс-мутация. Все выявленные мутации, за исключением 4 вариантов, представлены в базах данных по мутациям как «вероятно патогенные» или «патогенные». Четыре мутации – p.Q1204*, p.Q1291*, p.K1310RfsTer11 и p.E1353* – были выявлены впервые, и в базах данных по мутациям не описаны. Следует отметить, что у 4 больных обнаружены по 2 мутации в гене АРС.

Мутации в гене TP53 выявлены у 23 человек и в основном представлены миссенс-мутациями, приводящими к замене аминокислоты в белке (табл. 3). В двух случаях обнаружены редкие для гена ТР53 мутации: инсерция со сдвигом рамки считывания – p.V147GfsTer25 и нонсенс-мутация – p.R342*, приводящая к образованию преждевременного стоп-кодона в белковом продукте. Большая часть найденных мутаций, за исключением 3 вариантов – p.V147GfsTer25, p.R213* и p.R342*, – находится в так называемых «горячих точках» – наиболее часто мутирующих областях гена TP53 . Мутация p.V147GfsTer25 выявлена впервые и не описана в базах данных. Все остальные мутации представлены в базах данных как «вероятно патогенные» или «патогенные».

В остальных генах обнаружено значительно меньше изменений. В гене FBXW7 – у 7 пациентов, причем у одного из них были выявлены 2 мутации. По три мутации было выявлено в генах SMAD4 , SMAD2 , ATM, DMD и PIK3CA, по 2 мутации – в генах CTNNB1, TCF7L2 и по одной мутации – в генах DCC, MAP7 и PIK3R1 . У одного обследованного пациента было обнаружено 2 мутации в гене ATM (табл. 4).

Мутации в других генах, участвующих в патогенезе КРР, выявлены у 36 человек. При этом в 9 случаях дополнительно было выявлено по одной мутации, в 17 случаях – по 2 мутации, в 7 – по 3 мутации, в 3 случаях – по 4 мутации. Сочетание трех мутаций в ключевых генах KRAS, APC и TP53 выявлено у 15 (36 %) больных. Сочетание двух мутаций – в генах KRAS и APC – у 10 (24 %), а в генах KRAS и TP53 – у 8 (19 %) больных.

Обсуждение

Колоректальный рак представляет собой гетерогенную группу опухолей, отличающихся по молекулярно-генетическим характеристикам. Поэтому при назначении лечения больным КРР очень важно учитывать не только клинические факторы и функциональный статус пациента, но и молекулярный профиль опухоли. Известно, что примерно в 50–80 % случаев при КРР в опухоли наблюдается гиперэкспрессия гена EGFR , которая приводит к активному росту и делению клеток вследствие активации сигнального пути EGFR-RAS-RAF-MEK-MAPK [14]. При лечении КРР с диким типом гена KRAS применяют моноклональные антитела, способные блокировать рецептор EGFR. Однако мутации в гене KRAS, которые встречаются достаточно часто, делают такую блокировку рецептора EGFR бесполезной , а лечение неэффективным . Накопление данных о мутационном профиле опухоли и определение их связи с клинико-патологическими характеристиками помогают получить важную информацию о патогенезе заболевания, а также позволяют вести поиск новых возможностей для лечения КРР. Метод секвенирования нового поколения позволяет одновременно проанализировать большое количество генов и гораздо большие области, что обеспечивает высокую чувствительность данного

характеристика мутаций, выявленных в гене APC characterization of mutations identified in the APC gene таблица 2/table 2 Экзон/ Exon Нуклеотидный вариант/ Nucleotide variant Белковый вариант/ Protein variant Тип мутации/ Type of mutation База/Database COSMIC/cBioPortal База/ DatabasedbSNP 6 p.R213* c.637C > T Нонсенс/ Nonsense Вероятно патогенная/ Probably pathogenic Данные отсутствуют/ No data 7 p.R216* c.646C > T Нонсенс/ Nonsense Вероятно патогенная/ Probably pathogenic Патогенная/ Pathogenic 11 p.S457* c.1370C > A Нонсенс/ Nonsense Вероятно патогенная/ Probably pathogenic Данные отсутствуют/ No data 14 p.R564* c.1690C > T Нонсенс/ Nonsense Вероятно патогенная/ Probably pathogenic Патогенная/ Pathogenic 16 p.R1114* c.3340C > T Нонсенс/ Nonsense Вероятно патогенная/ Probably pathogenic Патогенная/ Pathogenic 16 p.Q1204* c.3610C > T Нонсенс/ Nonsense Данные отсутствуют/ No data Данные отсутствуют/ No data 16 p.Q1291* c.3871C > T Нонсенс/ Nonsense Данные отсутствуют/ No data Данные отсутствуют/ No data 16 p.Q1294* c.3880C > T) Нонсенс/ Nonsense Вероятно патогенная/ Probably pathogenic Данные отсутствуют/ No data 16 p.Q1303* c.3907C > T Нонсенс/ Nonsense Вероятно патогенная/ Probably pathogenic Данные отсутствуют/ No data 16 p.K1310RfsTer11 c.3926delA Делеция со сдвигом рамки считывания/ Frameshift deletion Данные отсутствуют/ No data Данные отсутствуют/ No data 16 p.G1312EfsTer9 с.3934delG Делеция со сдвигом рамки считывания/ Frameshift deletion Вероятно патогенная/ Probably pathogenic Данные отсутствуют/ No data 16 p.E1353* с.4057G > T Нонсенс/ Nonsense Данные отсутствуют/ No data Данные отсутствуют/ No data 16 p.Q1367* с.4099C > T Нонсенс/ Nonsense Вероятно патогенная/ Probably pathogenic Данные отсутствуют/ No data 16 p.Y1376* с.4128T > G Нонсенс/ Nonsense Вероятно патогенная/ Probably pathogenic Вероятно патогенная/ Probably pathogenic 16 p.Q1378* с.4132C > T Нонсенс/ Nonsense Вероятно патогенная/ Probably pathogenic Данные отсутствуют/ No data 16 p.S1400* с.4199C > A Нонсенс/ Nonsense Вероятно патогенная/ Probably pathogenic Вероятно патогенная/ Probably pathogenic 16 p.Q1406* с.4216C > T Нонсенс/ Nonsense Вероятно патогенная/ Probably pathogenic Данные отсутствуют/ No data 16 p.Q1444* с.4330C > T Нонсенс/ Nonsense Вероятно патогенная/ Probably pathogenic Данные отсутствуют/ No data 16 p.R1450* с.4348C > T Нонсенс/ Nonsense Вероятно патогенная/ Probably pathogenic Данные отсутствуют/ No data 16 p.S1465WfsTer3 c.4393_4394delAG Делеция со сдвигом рамки считывания/ Frameshift deletion Вероятно патогенная/ Probably pathogenic Патогенная/ Pathogenic 16 p.L1488YfsTer19 c.4463delT Делеция со сдвигом рамки считывания/ Frameshift deletion Вероятно патогенная/ Probably pathogenic Данные отсутствуют /No data 16 p.L1488FfsTer26 c.4463dupT Инсерция со сдвигом рамки считывания/ Frameshift insertion Вероятно патогенная/ Probably pathogenic Данные отсутствуют/ No data 16 p.E1536* c.4606G > T Нонсенс/ Nonsense Вероятно патогенная/ Probably pathogenic Данные отсутствуют/ No data 16 p.T1556NfsTer3 c.4666dup Инсерция со сдвигом рамки считывания/ Frameshift insertion Вероятно патогенная/ Probably pathogenic Данные отсутствуют/ No data таблица 3/table 3

характеристика мутаций, выявленных в гене TP53characteristics of mutations identified in the TP53 gene

Экзон/ Exon Нуклеотидный вариант/ Nucleotide variant Белковый вариант/ Protein variant Тип мутации/ Type of mutation База/Database COSMIC/ cBioPortal База/ Database dbSNP 5 p.V147GfsTer25 c.435_439dupGTGGG Инсерция со сдвигом рамки считывания/ Frameshift insertion Данные отсутствуют/ No data Данные отсутствуют/ No data 5 p.R175H c.524G>A Миссенс/Missense Патогенная/Pathogenic Патогенная/Pathogenic 6 p.H193N c.577C>A Миссенс/Missense Вероятно патогенная/ Probably pathogenic Данные отсутствуют/ No data 6 p.R213* c.637C>T Нонсенс/Nonsense Вероятно патогенная/ Probably pathogenic Данные отсутствуют/ No data 7 p.Y234H c.700T>C Миссенс/Missense Вероятно патогенная/ Probably pathogenic Данные отсутствуют/ No data 7 p.C238W c.714T>G Миссенс/Missense Патогенная/Pathogenic Патогенная/Pathogenic 7 p.C238Y c.713G>A Миссенс/Missense Патогенная/Pathogenic Данные отсутствуют/ No data 7 p.G245S c.733G>A Миссенс/Missense Патогенная/Pathogenic Патогенная/Pathogenic 7 p.R248W c.742C>T Миссенс/Missense Вероятно патогенная/ Probably pathogenic Патогенная/ Pathogenic 8 p.R273C c.817C>T Миссенс/Missense Вероятно патогенная/ Probably pathogenic Патогенная/ Pathogenic 8 p.R273L c.818G>T Миссенс/Missense Вероятно патогенная/ Патогенная/ Probably pathogenic Pathogenic 8 p.P278R c.833C>G Миссенс/Missense Вероятно патогенная/ Probably pathogenic Данные отсутствуют/ No data 8 p.R282W c.844C>T Миссенс/Missense Вероятно патогенная/ Probably pathogenic Патогенная/ Pathogenic 10 p.R342* c.1024C>T Нонсенс/Nonsense Вероятно патогенная/ Probably pathogenic Данные отсутствуют/ No data таблица 4/table 4

характеристика мутаций в других генах, выявленных в обследованной группе characterization of mutations in other genes identified in the examined group

£ о	Экзон/ Exon	Нуклеотидный вариант/ Nucleotide variant	Белковый вариант/ Protein variant	Тип мутации/ Type of mutation	База/Base COSMIC/cBioPortal	База / Database dbSNP
	4	p.A204T	c.610G>A	Миссенс/Missense	Данные отсутствуют/ No data	Неизвестное значение/
						Unknown value
				Инсерция со
	8	p.T385ins	c.1149_1153dupGATCA	сдвигом рамки считывания/	Данные отсутствуют/ No data	Данные отсутствуют/ No data
				Frameshift insertion
1 22	9	p.R465H	c.1394G>A	Миссенс/Missense	Вероятно патогенная/ Probably pathogenic	Данные отсутствуют/ No data
	10	p.R479P	c.1436G>C	Миссенс/Missense	Вероятно патогенная/ Probably pathogenic	Данные отсутствуют/ No data
	10	p.R479Q	c.1436G>A	Миссенс/Missense	Патогенная/ Pathogenic	Данные отсутствуют/ No data
	10	p.S546*	c.1637C>A	Миссенс/Missense	Вероятно патогенная/ Probably pathogenic	Данные отсутствуют/ No data
	12	p.R689W	c.2065C>T	Миссенс/Missense	Вероятно патогенная/ Probably pathogenic	Данные отсутствуют/ No data

Окончание таблицы 4/end of table 4

2 p.R88* c.262C>T Нонсенс/ Данные отсутствуют/ Данные отсутствуют/ с и 3 к Nonsense No data No data 2 p.G106V c.317G>T) Миссенс/ Missense Патогенная/ Pathogenic Данные отсутствуют/ No data 20 p.H1047R c.3140A>G Миссенс/ Патогенная/ Патогенная/ Missense Pathogenic Pathogenic 9 p.P356R c.1067C>G Миссенс/ Неизвестное значение/ Данные отсутствуют/ Q < с/> Missense Unknown value No data 12 p.D537G c.1610A>G Миссенс/ Missense Вероятно патогенная/ Probably pathogenic Данные отсутствуют/ No data 12 p.D537V c.1610A>T Миссенс/ Вероятно патогенная/ Данные отсутствуют/ Missense Probably pathogenic No data 4 p.R120* c.352C>T Нонсенс/ Данные отсутствуют/ Данные отсутствуют/ м Q с/> Nonsense No data No data 8 p.C312G c.934T>G Миссенс/ Missense Данные отсутствуют/ No data Данные отсутствуют/ No data 11 p.*468K c.1402T>A Потеря стоп кодона/ Данные отсутствуют/ Данные отсутствуют/ Stop codon loss No data No data 7 p.G208S c.622G>A Миссенс/ Данные отсутствуют/ Данные отсутствуют/ Missense No data No data 3 3 23 p.E1026D c.3078G>T Миссенс/ Неизвестное значение/ Данные отсутствуют/ Missense Unknown value No data 59 p.K2957N c.8871G>T Миссенс/ Данные отсутствуют/ Данные отсутствуют/ Missense No data No data 16 p.R805* c.2413C>T Нонсенс/ Вероятно патогенная/ Данные отсутствуют/ Nonsense Probably pathogenic No data S 18 p.S934N c.2801G>A Миссенс/ Данные отсутствуют/ Данные отсутствуют/ Missense No data No data 63 p.R3008H c.9023G>A Миссенс/ Патогенная/ Данные отсутствуют/ Missense Pathogenic No data 3 и 4 p.A152T c.454G>A Миссенс/ Missense Данные отсутствуют/ No data Данные отсутствуют/ No data 15 p.W776* c.2328G>A Нонсенс/ Данные отсутствуют/ Данные отсутствуют/ Nonsense No data No data м 3 3 и н 6 p.G229R c.685G>A Миссенс/ Missense Неизвестное значение/ Unknown value Данные отсутствуют/ No data 15 p.A562T c.1684G>A Миссенс/ Данные отсутствуют/ Данные отсутствуют/ Missense No data No data 5 4 p.P80L c.239C>T Миссенс/ Missense Данные отсутствуют/ No data Данные отсутствуют/ No data и 3 15 p.A769T c.2305G>A Миссенс/ Missense Неизвестное значение/ Unknown value Данные отсутствуют/ No data 3 з Инсерция со 16 p.A682PfsTer12 c.2043_2044insTTTTT сдвигом рамки считывания/ Данные отсутствуют/ No data Данные отсутствуют/ No data Frameshift insertion метода по сравнению с секвенированием по Сэнгеру или методом ПЦР.

В настоящем исследовании мы изучали мутационный статус опухолей у 42 пациентов с КРР с использованием коммерчески доступной панели NGS GeneRead DNASeq Targeted Panel v2 Human Colorectal Cancer («Qiagen», США) из 32 генов, участвующих в молекулярном патогенезе заболевания и выполняющих важную роль в регуляции клеточного роста, трансформации, адгезии, апоп- тозе и т.д. Полученные данные позволили идентифицировать мутации не только в горячих точках генов, обычно участвующих в патогенезе КРР, но и редкие и новые варианты, которые еще не описаны в базах данных по мутациям. Для многих выявленных вариантов генов уже имеется информация относительно их потенциальной роли в качестве прогностических и предиктивных маркеров. Значение других мутаций предстоит оценить в крупных клинических исследованиях.

Несколько ранее проведенных исследований были посвящены анализу мутационного статуса генов при КРР с применением метода NGS для выявления прогностически значимых маркеров и поиска новых мишеней для таргетной терапии [15–18]. В основном эти исследования проводились с использованием панели AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 (Life Technologies, США). В этих работах показана возможность успешного применения одного мультиплексного теста для анализа мутаций множества генов, ассоциированных с КРР. Авторы сходятся во мнении, что такой подход, с включением в обследование высокопроизводительного секвенирования, облегчает выявление лиц с высоким риском, помогает идентифицировать новые мутации, которые могут быть использованы в качестве мишеней для разработки лекарств, а также принимать решение при назначении терапии.

Известно, что для КРР характерна стадийность морфологической трансформации, обусловленная постепенным накоплением мутаций в онкогенах и супрессорных генах, ассоциированных с развитием заболевания [19]. Ключевыми генетическими изменениями при КРР являются мутации в генах KRAS, APC и TP53. Ген KRAS – протоонкоген, участвующий в активации сигнального пути EGFR (RAS/RAF/MAPК), тесно связан с пролиферацией опухолевых клеток. Активирующие мутации в гене KRAS приводят к конститутивной активации сигнальной трансдукции, что способствует клеточной пролиферации и злокачественной трансформации. Ген АРС – ген-супрессор опухоли, основными функциями которого является участие в регуляции транскрипции, апоптозе, клеточной адгезии, а также контроле клеточного цикла. Он является негативным регулятором сигнального каскада Wnt. В норме АРС ингибирует клеточную пролиферацию путем связывания β-катенина с последующим его разрушением. Однако при возникновении мутации он теряет способность связывать и разрушать β-катенин, в результате чего последний проникает в ядро и активирует транскрипцию ряда онкогенов, в том числе c-myc, циклин D1, которые являются промоторами клеточной пролиферации. Мутации в гене APC при спорадическом КРР встречаются довольно часто и могут составлять до 75 % случаев, мутации, как правило, возникают уже на ранней стадии развития опухоли [20, 21]. Ген TP53, изменения в котором наряду с геном APC чаще всего встретились в обследованной группе, является наиболее известным опухолевым супрессором, отвечающим за стабильное состояние генома. Он часто мутирует в различных типах опухолей. По данным литературы, мутации в гене TP53 при спорадическом КРР наблюдаются в 40–50 % [22]. По данным литературы, сочетание мутаций в трех ключевых генах (KRAS, APC, TP53) свидетельствует о более агрессивном характере заболевания [13, 16, 23].

В нашем исследовании из пациентов с комбинацией мутаций в трех ключевых генах ( KRAS, APC, TP53 ) большинство – 10 (67 %) – имели III и IV стадии заболевания. В этой группе прогрессирование заболевания отмечено у 10 (67 %) пациентов (у 8 – с КРР III или IV стадий, у 2 – с КРР II стадии), из них 8 больных (53 %) умерли в период наблюдения (27 мес). В то же время в группах с мутациями в двух генах KRAS/APC или KRAS/TP53 прогрессирование заболевания отмечено в 4 (40 %) и 4 (50 %) случаях соответственно. В течение всего периода наблюдения умерло 2 (25 %) больных из группы с мутациями в генах KRAS/TP53 и 3 (30 %) пациентов с мутациями в генах KRAS/APC. В группе пациентов, у которых не выявлены мутации в генах APC и TP53, а имелась лишь мутация в гене KRAS , 7 (77 %) человек имели КРР I или II стадии, 2 – КРР III или IV стадии. У 2 пациентов с КРР III и IV стадии отмечено прогрессирование заболевания, и они умерли в течение периода наблюдения.

Предварительные результаты исследования продемонстрировали, что сочетание 3 мутаций в ключевых генах, отвечающих за патогенез КРР ( KRAS, APC, TP53 ), является наиболее неблагоприятным фактором прогноза и свидетельствует о более высокой агрессивности опухолевого процесса. Дальнейшие исследования позволят уточнить полученные данные и, возможно, выявить новые особенности молекулярно-генетического профиля, характерные для КРР. Таким образом, поиск и идентификация генных мутаций у пациентов с КРР имеют важное значение не только для выбора тактики лечения, но и для прогноза заболевания. Дальнейшие исследования в этом направлении позволят уточнить выявленные закономерности и, возможно, получить ответ на вопросы, связанные с патогенезом КРР.

Заключение

Эффективное лечение большинства злокачественных новообразований, включая КРР, предполагает исследование молекулярного профиля опухоли. Одним из наиболее чувствительных и надежных способов идентификации мутаций в опухолевой ткани является метод секвенирования нового поколения (NGS), позволяющий анализировать десятки и сотни генов в одном исследовании. Полученная информация о мутационном статусе опухоли с учетом клинических характеристик позволяет персонифицировать тактику лечения, включая применение комбинации таргетных препаратов.