Mycobacterium smegmatis обладает активными генами метаболизма полиаминов

Полиамины представляют собой группу алифатических углеводородов, в которых два или более атома водорода заменены на аминогруппы. Среди биогенных полиаминов наиболее распространены путресцин (1,4-диаминобутан), кадаверин (1,5-ди-аминопентан), спермидин (N-(3-аминопропил)бу-тан-1,4-диамин) и спермин (N,N'-бис(3-амино-пропил)бутан-1,4-диамин). Последний более характерен для эукариотических организмов и редко обнаруживается в бактериях. В то же время, первые три соединения у микроорганизмов встреча- ются часто и способны выполнять в их клетках спектр разнообразных функций [Tabor, Tabor, 1985].

К настоящему времени показано, что полиамины могут выступать в качестве регуляторов транскрипции [Yoshida, Kashiwagi, Shigemasa, 2004; Ткаченко, Шумков, 2004], трансляции [Igarashi, Kashivagi, 2010] и стабильности белка [Tkachenko, Shumkov, 2004], влиять на проницаемость порино-вых каналов [Samartzidou, Delcour, 1999] и состояние мембраны, регулировать экспрессию генов за счёт изменения вторичной структуры мРНК [Yoshida et al., 1999] и т.д. Такое многообразие функций возможно в связи с наличием в молеку-

лах этих соединений аминогрупп, которые в физиологических условиях (рН=7.4) заряжены положительно и способны взаимодействовать с отрицательно заряженными компонентами клетки, в первую очередь, нуклеиновыми кислотами и фосфолипидами.

Одной из сложнейших проблем современной медицины является борьба с туберкулёзом. Возбудитель этого заболевания – Mycobacterium tuberculosis (MTB) – ежегодно инфицирует 9 млн чел., что приводит к 2 млн смертей в год [WHO, 2016]. Поскольку полиамины способны существенно изменять чувствительность бактерий к антибиотикам [Ахова, Ткаченко, 2009], имеет смысл изучить особенности их метаболизма в клетках микобактерий с целью предотвращения развития толерантности, а затем и резистентности МТВ к антибактериальным препаратам.

Из литературы известно, что полиамины оказывают положительное влияние на активность микобактериальной РНК-полимеразы [Jain, Tyagi, 1987; Sarkar, Shankar, Tyagi, 1995]. Как и в случае грамотрицательных бактерий, они снижают зависимый от поринов транспорт в клетку микобактерий антибактериальных препаратов и тяжёлых металлов [Sarathy, Lee, Dartois, 2013; Speer et al., 2013]. Более того, один из антимикобактериальных антибиотиков – этамбутол – по своей структуре напоминает спермин, а его механизм действия одно время связывали с ингибированием метаболизма полиаминов [Pöso, Paulin, Brander, 1983; Paulin, Brander, Pöso, 1985]. Вместе с тем, исследования влияния этамбутола на синтез спермидина очевидно противоречат имеющимся данным о распространении полиаминов у микроорганизмов, которые свидетельствуют о том, что клетки Mycobacterium smegmatis содержат лишь незначительные их количества или, возможно, не содержат совсем [Herbst, Weaver, Keister, 1958].

Таким образом, вопрос о наличии метаболизма полиаминов в микобактериях остаётся открытым. В настоящей работе, анализируя данные, полученные методами транскриптомики, протеомики и биохимии, мы возвращаемся к этой теме с целью определения работоспособности ферментов, ответственных за обмен полиаминов, и установления принципиальной возможности микобактерий содержать эндогенные полиамины.

Материалы и методы исследований

Условия культивирования . Для получения биомассы активной культуры клетки штамма M. smegmatis MC²155 культивировали аэробно в течение 28-30 ч. при 37 ° C в орбитальном термошейкере (200 об/мин) в колбах объемом 100 мл, содержащих 50 мл среды Nutrient Broth (NB, “Himedia”, Индия). Покоящиеся клетки

M. smegmatis получали, как описано ранее [Shleeva et al., 2011].

Протеомные исследования . Биомасса исследуемых штаммов была собрана через 30 ч. культивирования; затем проводили разрушение клеток и экстракцию белка. Белковые экстракты подвергли одномерному электрофорезу в денатурирующих условиях в полиакриламидном геле. Полученные гелевые дорожки обработали трипсином. Триптические экстракты использовали для тандемного масс-спектрометрического анализа, совмещённого с наножидкостной хроматографией. Анализ проводили на масс-спектрометре TripleTOF 5600+ с ионным источником NanoSpray III (AB Sciex, Канада), соединенным с нано-ВЭЖХ системой NanoLC Ultra 2D + (Eksigent, Singapore). Для количественного определения белков исходные файлы данных MS (файлы .wiff) импортировали и обработали в программе Progenesis LC-MS v.4.1 (Nonlinear Dynamics, Newcastle, UK).

Выделение РНК. Секвенирование нового поколения . Пробы РНК были выделены из культур M. smegmatis во время экспоненциального роста в среде NB и после перехода в состояние покоя. Бактериальные культуры быстро охлаждали на льду, центрифугировали и общую РНК выделяли фенолхлороформным методом из мембранных экстрактов, полученных, как описано ранее [Trutneva et al., in press]. Пробы мРНК были подготовлены и подвергнуты секвенированию нового поколения в соответствии с разаработанным ранее алгоритмом [Ignatov et al., 2015].

Анализ результатов RNA-seq . Последовательности прочтений РНК были выравнены в соответствии с контрольными последовательностями штамма М. smegmatis MC² 155 (номер доступа GenBank: CP000480). Транскрипционные профили визуализировали с помощью геномного браузера Artemis [Carver et al., 2012]. Анализ разницы уровней экспресии проводился с использованием пакета edgeR [Robinson, McCarthy, Smyth, 2010].

Содержание полиаминов . Концентрацию полиаминов определяли методом тонкослойной хроматографии. Подготовка проб перед анализом включала хлорно-кислую экстракцию с последующей дериватизацией полиаминов с помощью реакции дансилирования [Ткаченко, Пожидаева, Шумков, 2006].

Результаты и их обсуждение

Анализ транскриптов M. smegmatis указывает на возможность существования действующего метаболизма полиаминов . Поскольку в неблагоприятных условиях среды возможно накопление полиаминов в клетках бактерий [Ткаченко,

Шумков, Ахова, 2009], в настоящем исследовании были использованы культуры M. smegmatis , находящиеся в двух различных физиологических состояниях: активные клетки и покоящиеся формы. При анализе транскрипционного профиля таких культур нами были обнаружены мРНК генов, аннотированных в геноме M. smegmatis

eport=graph) как потенциально связанных с обменом полиаминов (табл. 1). Не все из них были представлены большим числом прочтений, тем не менее, полученная информация позволила реконструировать схему возможного метаболизма этих соединений.

Таблица 1

Обнаруженные при транскриптомном анализе гены метаболизма и транспорта полиаминов

Локус

Ген

Продукт

logFC

PValue

Активные, кол-во прочтений

Покоящиеся, кол-во прочтений

Синтез путресцина

MSMEG_026 6	speA-подобный	аргинин декарбоксилаза	-2.34628	8.50E-08	2564	296
MSMEG_107 2	speB	агматиназа	-0.23088	0.778282	38	19
MSMEG_353 5	speB	агматиназа	-1.61668	0.003053	110	21
MSMEG_437 4	speB	агматиназа	-1.94375	0.325869	7	1
MSMEG_445 9	speB	агматиназа	0.836831	0.192936	19	20

Деградация путресцина через γ-аминомасляную кислоту

MSMEG_166 5	patD-подобный	дегидрогеназа альдегида γ–аминомасляной к-ты	1.509033	0.000639	180	301
MSMEG_058 2	gabD-подобный	дегидрогеназа полуальдегида сукцината	2.671296	3.04E-08	52	195
MSMEG_330 4	gabD-подобный	дегидрогеназа полуальдегида сукцината	-3.48582	4.64E-14	2997	157
MSMEG_591 2	gabD2	дегидрогеназа полуальдегида сукцината	0.85144	0.04221	873	925
MSMEG_058 1	gabT	4-аминобутират аминотрансфераза	3.631123	1.83E-13	47	343
MSMEG_295 9	gabT	4-аминобутират аминотрансфераза	-0.80063	0.087518	187	63
MSMEG_668 5	gabT	4-аминобутират аминотрансфераза	-0.86097	0.048036	461	149

Транспорт полиаминов

MSMEG_044 6	-	Путресциновый импортер	-0.61401	0.338581	47	18
MSMEG_066 2	-	ATФ-связывающий белок транспорта путресцина PotG	-1.83979	0.000332	165	27
MSMEG_328 1	-	ATФ-связывающий белок ABC транспортера спер-мидина/путресцина	4.202154	1.20E-17	71	769

Примечание. logFC отражает изменение уровня представленности мРНК гена при переходе бактериальной культуры в состояние покоя, рассчитывается как логарифм по основанию 2 отношения количества прочтений в образце покоящихся клеток к количеству прочтений в образце активных клеток M. smegmatis . PValue характеризует уровень значимости различий транскрипции рассматриваемых генов в активном и покоящемся состоянии бактериальной культуры. Значения PValue≤0,01 (значимые различия) выделены жирным шрифтом.

Так, ясно обнаруживается путь синтеза поли- ным, тогда как основной синтез путресцина проис-аминов от аргинина до путресцина, включающий ходит при участии орнитин-декарбоксилазы SpeC. аргинин декарбоксилазу SpeA и агматин- Однако микобактериальный аналог данного гена уроеогидролазу (агматиназу) SpeB (рис. 1). Для нам найти не удалось.

энтеробактерий этот путь является дополнитель-

Аргинин     —»    агматин      —»    путресцин аргинин декарбоксилаза       агматиназа

Рис. 1 . Потенциальный путь синтеза путресцина в клетках M. smegmatis

Одним из путей деградации путресцина являет- стии γ-аминобутиральдегид дегидрогеназы (patD)

ся последовательность реакций, осуществляемая у энтеробактерий белками GabDTP. Это гамма-аминобутиратный путь разложения полиаминов. В нём путресцин при действии путресцин аминотрансферазы ( patA ) превращается в γ-аминобутиральдегид, из которого затем при уча-

Путресцин —» у-аминобутиральдегид получается γ-аминомасляная кислота, в дальнейшем перерабатываемая в полуальдегид сукцината (фермент GabT) и сукцинат (реакция, катализируемая GabD), «направляемый» в цикл трикарбоновых кислот (рис. 2).

—» /-аминомасляная кислота —*

путресцин аминотрансфераза

у-амннооутиралъдегид дегидрогеназа     у-амино бутират

—♦     полуальдегид сукцината     —♦     сукцинат аминотрансфераза сукцинат-полуальдегид дегидрогеназа

Рис. 2 . Потенциальный путь разложения путресцина в клетках M. smegmatis

Среди транскриптов, выделенных из клеток M. smegmatis , нами были обнаружены мРНК практически всех генов, продукты которых задействованы в этом пути, за исключением мРНК первого фермента – путресцин аминотрансферазы (табл. 1). Такая выраженная представленность транскриптов генов деградации путресцина могла бы с высокой вероятностью свидетельствовать о функционировании данного метаболического пути. Однако с уверенностью утверждать этого нельзя, поскольку для M. smegmatis и MTB характерен расширенный вариант цикла Кребса [Rhee et al., 2011], при котором α -кетоглутарат может не превращаться напрямую в сукцинат, а преобразовываться в глутаматдегидрогеназной реакции в глутамат (реакция осуществляется продуктом гена MSMEG_5442 ), с последующим переходом в γ-аминобутират (глутамат декарбоксилазная реакция, происходящая при участии аналога GadB E. coli – продукта гена MSMEG_1574 ) и далее до сукцината (ферментный комплекс GabTD).

Помимо транскриптов генов синтеза и деградации путресцина, нами также были обнаружены мРНК белков транспорта полиаминов (табл. 1), что свидетельствует о возможности попадания этих соединений в клетку извне.

Таким образом, в клетках M. smegmatis в активной фазе роста гены метаболизма полиаминов транскрипционно активны.

Стоит заметить, что в покоящихся клетках M. smegmatis, в сравнении с активно делящимися, транскрипция ряда генов существенно изменяется. Так, обнаруживается закономерное уменьшение представленности транскриптов генов синтеза путресцина (speA (MSMEG_0266) и speB (MSMEG_3535)) и возрастание представленности мРНК генов его деградации (patD (MSMEG_1665), gabT (MSMEG_0581) и gabD (MSMEG_0582)), что хорошо согласуется со снижением метаболической активности микобактериальных клеток в этих ус- ловиях. В то же время, один из генов разложения путресцина – gabD MSMEG_3304 – при переходе в покой неожиданно продемонстрировал выраженное снижение экспрессии. Вероятно, это связано с преимущественной активностью различных изоферментов в тех или иных физиологических состояниях.

В целом, проведённый анализ транскрипционного профиля M. smegmatis позволяет с достаточной уверенностью предполагать существование в клетках микобактерий разного физиологического состояния действующего метаболизма полиаминов. Вместе с тем, наличие транскриптов, очевидно, не означает присутствия в клетке соответствующих белков. Исходя из этого, закономерным продолжением работы стал анализ протеома M. smegmatis .

Белковый профиль подтверждает возможность присутствия полиаминов в клетках M. smegmatis . В лизатах активных микобактериальных клеток удалось обнаружить белки всех метаболических путей, выведенных на основе анализа транскриптов. Были найдены как ферменты биосинтеза путресцина (агматиназа, SpeB), так и белки, ответственные за разложение этого соединения (γ-аминобутират аминотрансфераза, GabT, и сук-цинат-полуальдегид дегидрогеназа, GabD). Белки системы транспорта полиаминов также проявили себя: в исследованных образцах присутствовали импортёр путресцина (MSMEG_0446) и АТФ-связывающий белок АВС-транспортера путресци-на/спермидина (MSMEG_3281).

Представленность ферментов тех или иных последовательностей химических реакций оказалась неполной (табл. 2). Однако, возможно, часть потенциально экспрессируемых белков не попали в поле нашего зрения в силу особенностей функционирования клетки или не были детектированы вследствие их низкой концентрации.

Возможно также, для некоторых аннотированных белков приписанная им функция является лишь предположением. Так, например, считается, что GabD2 (MSMEG_5912) входит именно в состав γ-аминобутиратного (ГАМК) шунта, поскольку несёт домен связывания с НАДФ. Для альтернативной дегидрогеназы полуальдегида сукцината GabD (MSMEG_3304) подобная аннотация отсутствует, однако в ней также найдена последовательность, обеспечивающая взаимодействие с НАДФ. Среди γ-аминобутират аминотрансфераз (GabT) наилучшим образом аннотирован белок MSMEG_2959. Ему приписывается также связан- ная с ГАМК-шунтом функция катализа реакции образования полуальдегида сукцината и глутамата из γ-аминобутирата и α-кетоглутарата. Хотя участие конкретного фермента в метаболизме полиаминов ни в одном из случаев не упоминается, установление в результате проведённого анализа белкового профиля факта, что гены метаболизма полиаминов в клетках M. smegmatis не только транскрибируются, но экспрессируются до уровня полипептидов, делает возможность существования метаболизма эндогенных полиаминов в клетках микобактерий ещё более вероятной.

Таблица 2

Идентифицированные ферменты метаболизма полиаминов и белки их транспорта

Локус

Ген

Продукт

Номер в базе данных RefSeq (NCBI)

Синтез путресцина

MSMEG_1072	speB	агматиназа	YP_885468.1
MSMEG_3535	speB	агматиназа	YP_887838.1

Деградация путресцина через GABA

MSMEG_3304	gabD like	дегидрогеназа полуальдегида сукцината	YP_887614.1
MSMEG_5912	gabD2	дегидрогеназа полуальдегида сукцината	YP_890138.1
MSMEG_0581	gabT	4-аминобутират аминотрансфераза	YP_884992.1
MSMEG_2959	gabT	4-аминобутират аминотрансфераза	YP_887278.1
MSMEG_6685	gabT	4-аминобутират аминотрансфераза	YP_890893.1

Транспорт полиаминов

MSMEG_0446	-	Путресциновый импортер	YP_884859.1
MSMEG_3281	-	ATФ-связывающий белок ABC транспортера спермидина/путресцина	YP_887592.1

Биохимический анализ клеток M. smegmatis полиаминов не выявил . Непосредственная оценка содержания полиаминов в клетках M. smegmatis была проведена с использованием метода тонкослойной хроматографии их дансилированных производных [Ткаченко, Пожидаева, Шумков, 2006]. В хлорнокислых экстрактах микобактериальной биомассы, позволяющих определить долю свободных полиаминов, эти соединения обнаружить не удалось.

Заключение

Таким образом, в настоящей работе впервые продемонстрирована транскрипция генов метаболизма полиаминов и синтез соответствующих ферментов в клетках M. smegmatis . Обнаружить присутствие самих соединений не удалось, но, возможно, это связано с низкой равновесной концентрацией полиаминов в клетках (за счёт их быстрого синтеза-распада) или присутствии их в состоянии, связанном с полианионными компонентами клетки.

Судя по всему, внутриклеточная концентрация полиаминов у M. smegmatis существенно ниже, чем у грамотрицательных бактерий. И, вероятно, полиамины не играют той многообразной роли, которая показана для них в случае энтеробактерий или клеток эукариот. Тем не менее, они вполне могут проявлять себя при каких-либо стрессовых воздействиях или в специфических условиях, которые ещё предстоит выявить.

Работа частично поддержана грантом РФФИ №16-04-01118-А.