Накопление цинка в семенниках крыс при многократном энтеральном введении наноформы гидроксида цинка

Введение. Сперматогенез представляет собой комплексный процесс пролиферации и дифференциации половых клеток, результатом которого является образование сперматозоидов [1]. Важную роль играет барьер из плотно соединенных между собой клеток Сертоли, который создает специализированную микросреду для развития и поддержания жизнеспособности развивающихся сперматозоидов. Данная среда должна содержать в себе оптимальный состав питательных веществ и микронутриентов, обеспечивающих нормальное протекание процесса сперматогенеза [2, 3]. Немаловажной функцией клеток Сертоли является барьерная, благодаря которой обеспечивается защита от токсикантов и точная регуляция количеств поступающих микроэлементов и питательных веществ.

Немаловажную роль на каждом из этапов сперматогенеза играет цинк, выполняющий главным образом структурную функцию как кофактор ферментов. В литературе описаны нарушения сперматогенеза у лабораторных животных при употреблении цинкдефицит-ного корма [4].

Растет интерес к исследованию в экспериментах in vivo наноразмерных форм цинка, что обусловлено в первую очередь улучшенными характеристиками их накопления в органах и тканях [5–7]. Изучение накопления наноформ цинка в тканях семенников немаловажно и с точки зрения выявления токсичности наночастиц для репродуктивной системы.

Ранее нами была получена наноформа гидроксида цинка [8], которая обладает более интенсивной характеристикой накопления в эритроцитарной массе крови крыс и большей скоростью накопления в плазме крови по сравнению с растворимым сульфатом цинка [9].

Цель исследования. Изучение динамики накопления цинка в тканях семенников при энтеральном введении наноформы гидроксида цинка в сравнительном аспекте с сульфатом цинка.

Материалы и методы. Для проведения экспериментального исследования были использованы 108 крыс-самцов породы Wistar, отобранных по массе тела в диапазоне 150–180 г. Животные были разделены на 3 группы по 36 крыс: первая группа получала энтерально суспензию наноформы гидроксида цинка в дистиллированной воде (100 мг/кг), вторая группа – раствор сульфата цинка – соединение сравнения (100 мг/кг). Третью группу (контрольную) составили животные, которым внутрижелудочно вводилась дистиллированная вода.

Введение изучаемых соединений производилось один раз в день по схеме: 0 – 24 – 48 – 72 – 120 – 168 ч. Спустя 4 ч после введения у наркотизированных хлоралгидратом животных осуществлялось взятие образцов крови и семенников.

Экспериментальная работа была выполнена на базе НИИ экологической медицины ФГБОУ ВО «Курский государственный медицинский университет» Минздрава России. Крысы перед началом исследования прошли двухнедельный карантин и содержались при контролируемых параметрах микроклимата (влажность 40–60 %, температура 21–24 °C), был также организован искусственный двенадцатичасовой день. Во время эксперимента животные получали стандартный экструдированный гранулированный полнорационный комбикорм для лабораторных животных ПК-120 (ГОСТ Р 51849-2001) и питьевую профильтрованную воду в количестве adlibitum. За 12 ч до введения исследуемых соединений крыс лишали корма, предоставляя свободный доступ к питьевой воде. На стадии планирования и реализации исследо- вания руководствовались требованиями директивы 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях, от 22 сентября 2010 г.

Синтез наноформы гидроксида цинка, использованной для исследования, проводился конденсационным методом в среде абсолютированного этанола реакцией между ацетатом цинка и гидроксидом лития. Распределение частиц по размеру изучалось методом малоуглового рентгеновского рассеяния на энергодисперсионном рентгенофлуоресцентном спектрометре EDX-800HS (Shimadzu, Япония) [9]. Было определено, что наночастицы обладают размером 2–3 нм.

Для предварительной пробоподготовки тканей и биологических жидкостей использовался метод «мокрого» озоления в концентрированной хлорной кислоте (72 %) при 210 °С с доокислением перекисью водорода (36 %) [10]. Завершение минерализации определялось визуально по изменению цвета раствора до прозрачного.

Определение концентрации цинка в ми-нерализатах производилось методом пламенной атомно-абсорбционной спектрометрии на спектрометре «СПЕКТР-5-4» (ОАО «Союз-цветметавтоматика», Россия, номер в Государственном реестре средств измерений 13743-04). Перед началом работы оборудование калибровалось по 7 концентрационным точкам (концентрация Zn2+ от 0,001 до 3,000 мг/дм3). Растворы для калибровки готовились из государственных стандартных образцов цинка с концентрацией 1 г/дм3 (ООО «Центр стандартных образцов и высокочистых веществ», Россия).

Для характеристики полученных экспериментальных данных рассчитывалась средняя арифметическая (M), медиана (Me), стандартное квадратичное отклонение средней арифметической (SD), стандартная ошибка средней арифметической (m). Для определения статистической значимости различий средних величин между экспериментальными группами использовался непараметрический критерий Манна–Уитни. Различия считались достоверными при уровне значимости p≤0,05.

Результаты и обсуждение. По результатам количественного определения Zn²⁺ построены кривые, характеризующие процесс его накопления в тканях семенников (рис. 1).

В группе, получавшей наночастицы гидроксида цинка, наблюдался быстрый рост концентрации цинка в семенниках, которая к 168 ч достигла значения 10,24±0,21 мкг/г.

Эти данные сопоставимы с полученными в группе, где вводился сульфат цинка: к концу эксперимента концентрация цинка в группе сравнения составила 10,34±0,14 мкг/г. Следует отметить, что рост концентрации цинка в группе сравнения начался только с 72 ч, в то время как в основной группе – сразу после введения.

Время в эксперименте, ч

Рис. 1. Динамика накопления Zn²⁺ в семенниках крыс:

A – группа, получавшая наноразмерный Zn(OH)2; B – группа, получавшая ZnSO4.

Примечание. * – достоверность различия показателей по отношению к контрольной группе (р≤0,05)

В группе, получавшей наночастицы гидроксида цинка, отмечалась тенденция к стабильному накоплению Zn2+ уже начиная с 48 ч и вплоть до конца эксперимента (рис. 1). Не наблюдалось снижения уровня цинка в семенниках в период прекращения введения исследуемого соединения. Уровень цинка к концу эксперимента увеличился на 6,57 мкг/г, что примерно в 2,5 раза больше по сравнению с контрольной группой. В группе, в которой вводился сульфат цинка, тенденция к накоплению ионов цинка в семенниках наметилась только со 120 ч, однако их концентрация к концу эксперимента была сходной с показателем первой группы (рис. 2). Отмеченная высокая тенденция к накоплению наноразмерного соединения цинка связана с размером частиц, которые легко преодолевают гематотестику-лярный барьер из клеток Сертоли. Для сульфата цинка, который всасывается в виде ио- нов, требуется связывание с белками-переносчиками и ряд других длительных стадий, в результате чего его накопление начинается не сразу. Кроме того, избирательное пропускание гематотестикулярного барьера не дает ионам цинка проникать в семенные канальцы только при повышении общего уровня цинка в орга- низме, для успешного проникновения через барьер требуется еще ряд факторов.

Во временном промежутке до 72 ч наноформа гидроксида цинка характеризуется более интенсивным накоплением - 6,55±0,77 мкг/г по сравнению с накоплением препарата сравнения - 4,02±0,31 мкг/г (рис. 2).

контрольная группа (1)

сульфат цинка (2)

наноформа гидроксида цинка (3)

Рис. 2. Сопоставление концентраций цинка в контрольной группе, группе, получавшей сульфат цинка, и группе, получавшей наноформу гидроксида цинка, в 4 ч (А), 72 ч (В) и 168 ч (С).

Примечание. * - достоверность различия показателей по отношению к контрольной группе;

# - достоверность различия показателей по отношению к группе сравнения (р<0,05)

При сопоставлении концентрации цинка в семенниках и эритроцитарной массе крови было обнаружено, что в группе, где вводилась наноформа гидроксида цинка, на протяжении всего эксперимента данные показатели не имели статистически значимых различий (рис. 3). Однако в группе, получавшей сульфат цинка, после 72 ч уровень цинка в эритроцитарной массе оказался статистиче- ски значимо ниже, чем в тканях семенников (рис. 3).Полученные результаты могут быть обусловлены в первую очередь специфической способностью наночастиц к адсорбции на эритроцитах [10], что позволяет наноформе дольше находиться в кровяном русле, обеспечивая постоянное поступление наночастиц к тканям семенников.

4 часа

D

E

168 часов

F

Рис. 3. Сопоставление концентрации цинка в эритроцитарной массе и тканях семенников в группе, получавшей наноформу гидроксида цинка (А, В и С), и в группе, получавшей сульфат цинка (D, F и Е).

Примечание. * – достоверность различия показателей по отношению к данным по концентрации цинка в эритроцитарной массе (р≤0,05)

Смещение распределения сульфата цинка между форменными элементами крови в сторону плазмы крови может быть связано с особенностями транспорта растворимых соединений цинка и может обеспечивать формирование пула цинка в других органах, например в печени. Данное предположение подтверждено нами в экспериментах на крысах, где было зарегистрировано более интенсивное накопление цинка в тканях печени в случае введения растворимого сульфата цинка по сравнению с наноформой гидроксида цинка [9]. Транспорт наночастиц в организме к органам и тканям может быть осуществлен двумя путями: полным растворением в ЖКТ или проникновением частиц в неизменном виде в кровяное русло [12]. Поскольку наноформа представляет собой коллоидные частицы, окруженные стабилизирующей оболочкой из противоионов [8], то растворение наноформы в желудочном соке затруднено, механизм их всасывания и транспорта отличается от механизма продвижения растворимой формы. Таким образом, наночастицы, адсорбировавшись на поверхности эритроцитов, поступают к тканям семенников быстрее, чем ионы Zn2+, которые сначала формируют пул, а только затем транспортируются.

Однако избыточное поступление наночастиц цинка через барьер из клеток Сертоли может оказывать отрицательное действие на процессы сперматогенеза. В работе [13] установлена цитотоксичность наночастиц оксида цинка (70 нм) в отношении клеток Сертоли и Лейдига, возрастающая дозозависимо. Описано негативное влияние наночастиц оксида цинка, введенных энтерально в дозе 50–300 мг/кг, на протекание сперматогенеза у крыс [3]. Механизм токсического действия объясняется авторами формированием активных форм кислорода (reactive oxygen spieces) и, как следствие, повреждением митохондрий клеток [14].

Однако имеются данные о том, что совместное введение наночастиц оксида цинка (доза 5 мг/кг) и циклофосфамида (доза 15 мг/кг) мышам снижает негативное влияние на сперматогенез последнего [15].

Заключение. Таким образом, результаты анализа концентрации цинка в семенниках крыс, которые получали наноформу гидроксида цинка и сульфат цинка в дозе 100 мг/кг, позволяют сделать вывод о более быстром накоплении цинка в тканях семенников в первые 72 ч приема для наноформы (6,55±0,77 против 4,02±0,31 мкг/г, р≤0,05).

К концу эксперимента уровень накопления Zn2+ в семенниках не имел статистически значимых межгрупповых различий

(10,24±0,86 и 10,34±0,44 мкг/г для наночастиц гидроксида цинка и сульфата цинка соответственно, р>0,05).

Различия в накоплении Zn2+ могут быть объяснены особенностями транспорта наноформы, которая всасывается в кровяное русло в неизменном виде.

Полученные в ходе эксперимента данные характеризуют наноформу гидроксида цинка как перспективное соединение, обладающее улучшенными характеристиками транспорта в отношении семенников. Однако окончательное заключение может быть дано только после проведения токсикологических исследований и дополнительного гистологического изучения тканей семенников.