Накопление полигидроксиалканоатов в клетках родококков при несбалансированном росте

(С Максимова Ю. Г., Бурлуцкая E. Ю., 2016

Alcaligenes eutrophus) - микроорганизм-суперпродуцент, который способен аккумулировать ПГА в количестве 80% от абсолютно сухой биомассы [Anderson, Dawes. 1990; Sudesh, Abe, Dol 2000: Волова и др,, 2007]. Он используется в промышленном масштабе для производства биодеграда бел ьного термопластика [Волова, Шишацкая, 2011].

Способность к накоплению ПГА известна у представителей большого количества родов микроорганизмов из разнообразных экологических ниш - деструкторов углеводородов Pseudomonas, J cineiobacter, Sphingobactenum, Brochothrix, С 'a и lob acter, Ralston ia_Y Bwkhcdderia_Y Yokene! la [Dalal et al., 2010]; галофилов Halobacterium, Haloferax, Ha!onion as, Haloarc и la [Quillaguamran el aL 2010; Saharan, Grewal. Kumar, 2014]; фотосинтетиков - цианобактерий [de Philippis et al., 1992: Nishioka et at, 2001: Panda. Sharma. Mallick, 2005]; ризосферных бактерий Azotobacter, A zospiri 11am _h Sinorh izobiam _h Rh izob Ium, Bradvrhizobhmr Mesorhizobium [Trainer, Charles, 2006: Ratcliff, Kadam. Denison, 2008]: стрептомицетов - продуцентов антибиотиков [Manna, Banerjee, Paul, 1999]: светящихся бактерий [Бояндин и др,, 2008]: бактерий аэробного и анаэробного активного ила [Bengtsson et aL 2008: Vcnkatcswar Reddy et al., 2012: Venkateswar Reddv, Venkata Mohan, 2012; Cavaille et al. 2013; Lee et at, 2015; Cha et al., 2016], В то же время незаслуженно мало внимания уделяется изучению биосинтеза ПГА у актинобактерий рода Rhodococcus. известных своим биодеградативным потенциалом и способностью к росту на различных углеводородных субстратах [Ившина, Пшсничнов, Оборин, 1987; Соляникова и др., 2010; Ившина и др,, 2011], Только единичные работы посвящены изучению биосинтеза ПГА и генов, вовлеченных в метаболизм этих соединений у родококков [Pieper, SteinbucheL 1992; Anderson et al., 1995; Hernandez et al., 2008; Matias et al., 2009].

Известно, что при недостатке в среде культивирования элементов, необходимых для синтеза компонентов бактериальной клетки, избыток углеродных субстратов приводит к накоплению в ней запасных питательных веществ. Синтез и деградация ПГА в нормальных условиях происходят одновременно, поэтому, чтобы достигнуть эффективной аккумуляции этих веществ, ферменты биосинтеза ПГА должны быть индуцированы, тогда как деградации - ингибированы [Kim, Park, Lee, 1996]. Однако не до конца ясно, какое сочетание лимитированных и избыточных элементов в среде культивирования способно привести к максимальном}7 накоплению ПГА в клетках родококков. При этом интересен вопрос о предпочтительном углеродном субстрате, наличие которого в среде культивирования приводит к максимальному синтезу ПГА у различных групп микроорганизмов. Так, есть сведения. что таким субстратом может являться бутират [Marang et al.. 2013]. Также механизм образо вания запасных питательных веществ часто изучается у культур микроорганизмов, растущих на простых, легко биодеградируемых субстратах, таких как ацетат или глюкоза [Biros et al.. 2014].

В связи с этим, целью настоящей работы являлось сравнение уровня накопления ПГА в клетках бактерий рода Rhodococcus при росте на содержащих различные источники углерода средах, лимитированных по азогу^т или фосфору.

Материалы и методы исследования

Бактериальные штаммы Rhodococcus erythro-polis ПЗ-8, 4-1, 6-21 и R* ruber П5-8, изолированные из почв Пермского края и способные к гидролизу и синтезу сложных эфиров [Осипова, Рсмс-зовская, Максимов, 2015], культивировали последовательно на среде 1 и среде 2. Среда 1 служила для накопления биомассы и была сбалансирована по источникам углерода, азота и фосфора. Она состояла из минеральной основы, содержащей (г/л): КН₃РО₄ - L0: К₂НГО₄^ЗН₃О - 1,6; NaCl - 0.5; MgSO₄^x7H₂O - 0.5, микроэлементы СаС1₂ - 0.005; FcSO₄x7H₂O - 0,01; СоСГ^бНзО - 0,01; pH 7.2±0.2. Источником азота являлся 0.01 М хлорид аммония, источниками углерода — глюкоза (0.1%), сахароза (0.1%), ацетат натрия (0.02 М), бутират натрия (0.1 М). Среда 2 служила для синтеза ПГА и была дефицитной по азоту, в этом случае пред-ставляла собой минеральную основу, как в среде Г без источника азота с глюкозой (5%), сахарозой (5%), ацетатом натрия (0.2 М), бутиратом натрия (0,5 М) в качестве источников углерода. В случае дефицитной по фосфору среды 2 ее основой был физиологический раствор (0,9%-ный хлорид натрия), содержащий микроэлементы, как в среде I, и хлорид аммония (0.01 М). Концентрация источников углерода соответствовала таковым безазоти-стой среды.

Культивирование проводили в колбах Эрлсн-мейера объемом 100 мл в 50 мл среды 1 в течение 5 дней при температуре 25°С на шейкере со скоростью перемешивания 140 об/мин. затем переносили в стерильные центрифужные пробирки, центрифугировали 20 мин. при 10 000 g, отмывали однократно от среды стерильным физиологическим раствором, и вносили 10 мл среды 2, Культивировали в тех же условиях еще 5 дней, центрифугировали, высушивали биомассу до постоянного веса и определяли общее содержание ПГА.

Биомассу гидролизовали в концентрированной серной кислоте на водяной бане при температуре 100°С в течение часа, концентрацию кротоновой кислоты определяли спектрофотометрически при 235 нм по калибровочному графику, построенному по оптической плотности кротоновой кислоты возрастающей концентрации, которая была получена в тех же условиях из поли [(R)-3-гидроксибутирата] (Sigma-Aldrich, Германия).

Контролем служили культуры, выращенные в течение суток на полноценной среде Луриа-

Бертани (LB).

Микрофотографии получали в световом микроскопе Leica DM LS (Германия) с фазовым контрастом при увеличении 1000 раз.

Статистическую обработку проводили с использованием непара метрического Т-критерия Вилкоксона и U-критерия Манна-Уитни с использованием пакета стандартных программ Statistica 10.0 (fl StatSoft 1псЛ 2012). Различия считали значимыми при р<0.05>

Результаты и их обсуждение

Изучено накопление ПГА в клетках родококков при двустадийном выращивании. Среда. сбаланси

Таблица 1

Накопление ПГА у родококков при росте на средах^ лимитированных по азоту и фосфоруi мкг/мг

Источники угле-рода	Штаммы
	R. erythropolts ПЗ-8	R. erythropoiis 4-1	R. ruber П5-8	R. erythropolis 6-21
Среда, лимитированная по азоту
Ацетат натрия	109.0 ±33.5	62.2±3.4	88 2±14.3	128.5±35.9
Бутират натрия	70.5±0.0	67.4±0.0	64.1±0.0	41.1±0.0
Глюкоза	60.3±44	60.1±49	77 6±6.9	64,7±35
Сахароза	84.3±35	120.1±332	85.5±78	66.6±3 4
	Среда,	лимитированная по фосфору
Ацетат натрия	36.5±0.0	40.7±0.0	466.7±0.0	40.8±00
Бутират натрия	31.0±0.0	58.9±0.0	312.5±0.0	31.1±00
Глюкоза	84.2±0.0	70.1±0.0	64.Н0.0	67.2±0.0
Сахароза	57.1±0.0	73.7±0.0	124.0±0.0	57.3±0.0
Среда LB
Полноценная среда	31.Ш.1	38.6W.8	62.5±5.9	42.5±2.7

Сравнивали влияние различных источников углерода при росте на несбалансированных средах на накопление ПГА в клетках родококков. При вычислении Т-критсрия Вилкоксона нс было обнаружено значимых различий в накоплении этих запасных питательных веществ как при росте изученных штаммов на разных источниках углерода, так и между образованием ПГА в клетках на среде, лимитированной по азоту, и среде, лимитированной по фосфору. Наименьший р-уровень значимости составлял 0.068 при сравнении содержания ПГА в клетках родококков, выращенных на LB и среде без азота с глюкозой, сахарозой и ацетатом. без фосфора с глюкозой и сахарозой.

Была изучена морфология клеток штаммов R. erythropobs 4-1 и R. ruber П5-8 на 5< сутки культивирования на среде 2, лимитированной по азоту или фосфору, с бутиратом иж ацетатом натрия в качестве источников углерода (рис. 1-10). В клетках 7?. ruber П5-8 на среде, лимитированной как по азоту, так и по фосфору, как на бутирате, так и на ацетате натрия, в клетках заметны опалесцирующие включения ПГА (рис. 7-10). Заметное изменение морфологии/?, ruber П5-8 отмечается при росте на среде, дефицитной по азоту (рис. 7, 8). Клетки имеют неравномерные утолщения, палочки неровные, не наблюдается длинных ветвящихся клеток. Однако у R. eryihropobs 4-1 опа рованная по источникам питания, способствовала накоплению биомассы, в то время как перенос в Среду, ЛИМИТИрОБаннуЮ ПО ОДНОМ}' из источников питания, приводил к накоплению ПГА в клетках. Наибольшее количество ПГА было накоплено в клетках R. ruber П5-8 при росте на среде, лимитированной по фосфору, с ацетатом или бутиратом натрия в качестве источников углерода (табл. 1). При вычислении U-кригерия Манна-Уитни было определено, что накопление ПГА только у R. ruber П5-8 при росте на нс сбалансированных по азоту и фосфору средах значимо отличается от других штаммов (UyMIL = 11-13, р < 0.05).

лесцирующие включения отмечены только при росте на лимитированной по азоту среде (рис. 2, 3). Значительного изменения морфологии клеток этого штамма нс выявлено ни при росте без азота, ни при культивировании на бесфосфорной среде (рис. 2-5).

При сравнении урожая клеток (табл. 2) было показано, что максимальная биомасса может быть получена при двустадийном росте R. ruber П5-8 на сбалансированной среде с бутиратом натрия как источником углерода, с переносом биомассы на среду⁷, лимитированную по источнику фосфора, с бутиратом натрия, добавленным в избытке. Остальные значения, отражающие накопление биомассы, были близки у изученных штаммов при росте на вышеперечисленных вариантах питательных сред.

Таблица 2

Урожаи биомассы на несбалансированных средах, мг АСБ/мл

Вещество	R. erythropohs 4-1	R. ruber П5-8
Среда, лимитированная по азоту
Ацетат натрия	0.28	0.24
Бутират натрия	0.56	0,55
Глюкоза	0.44	0.43
Сахароза	0.24	0,64

Рис. 1-10. Морфология R. erythropolis 4-1 (1-5) и R. ruber 115-8 (6-10) при росте на полноценной (LB) (1, 6) и лимитированной по азоту (2, 3, 7, 8) или фосфору (4, 5, 9, 10) средах с бутиратом натрия (2, 4, 7, 9) или ацетатом натрия (3, 5, 8, 10).

Масштабная линейка соответствует 20 мкм

Окончание табл. 2

Вещество	/?. erythropohs 4-1	R. ruber П5-8
Среда, лимитированная по фосфору
Ацетат натрия	L70	2.83
Бутират натрия	2.29	9.41
Глюкоза	L54	2.22
Сахароза	L78	0.60

Таким образом, наиболее перспективным штаммом из изученных является R. ruber П5-8, накапливающий наибольшее количество ПГА на среде, лимитированной по фосфору. Также у этого штамма отмечаются заметные изменения морфологии клетки, связанные, по-видимому, с ростом на несбалансированной среде, и наибольшее накопление биомассы при росте на среде с бутиратом натрия, лимитированной по фосфору.

Работа поддержана Комплексной программой Уральского отделения РАН (0426-2015-0028). проект № 15-4-4-26 «Биосинтез и биокаталитическая трансформация полимерных соединений».