Наносенс и калибровка портативных биосенсорных аналитических устройств с использованием ДНК-биодатчиков

Спектрометры оптического кругового дихроизма (КД) — дихрометры — используются во многих лабораториях для изучения физико-химических свойств природных соединений и химических веществ, в том числе их оптической активности. В последнее время дихрометры стали широко применяться в портативных биосенсорных аналитических системах с использованием в качестве биодатчиков "жидких" частиц холестерической жидкокристаллической дисперсии (ХЖКД) или наноконструкций (НаК) двухцепочечной ДНК, в которых молекулы ДНК пространственно упорядочены и "сшиты" между собой различными наномостиками [1, 2]. Для биодатчиков на основе НаК ДНК характерна не только аномальная оптическая активность, проявляемая в виде интенсивной полосы в спектре КД на длине волны ~ 260– 270 нм, но и дополнительная аномальная оптическая активность в области поглощения элементов наномостиков (450–650 нм), "сшивающих" НаК ДНК, в частности хромофоров антибиотиков. Величина аномальной оптической активности таких биодатчиков в полосе поглощения антибиотика остается неизменной в течение длительного времени и может уменьшаться (вплоть до полного исчезновения) под действием биологически активных соединений (БАС), "мишенью" для которых служат структурные элементы наномостиков. Встраивание в структуру "жидких" частиц ХЖКД ДНК биологически активных соединений (например, противоопухолевых антибиотиков) также приводит к появлению в спектре кругового дихроизма дополнительной аномальной полосы в видимой области спектра, амплитуда которой исполь- зуется для установления в анализируемой жидкой среде их наличия и концентрации.

Задачу исследования оптических свойств и контроля качества биодатчиков на основе ДНК, а также изменения этих свойств при взаимодействии с БАС можно решать с использованием портативных дихрометров, работающих как в широком диапазоне длин волн от 200 до 750 нм (излучатель — ксеноновая лампа), так и на дискретных длинах волн (источники — миниатюрные светоизлучающие диоды), одна из которых — 270 нм, а другие в полном соответствии с особенностями спектра КД ДНК-биодатчиков, — на длинах волн дополнительной аномальной полосы КД в видимой области спектра. Важным требованием при этом остается точность измерений дихрометром величины оптической активности исследуемого биодатчика в исходном состоянии и при его взаимодействии с БАС. Важно также, чтобы соединения, используемые в качестве эталонов оптической активности, были стабильными и могли воспроизводить эту характеристику в течение длительного периода. Для повышения точности калибровки желательно, чтобы характерные рабочие линии в спектре КД эталонных соединений находились в области длин волн, в которой используется дихрометр биосенсорной системы.

В качестве эталонных соединений для измерения регистрируемой дихрометром характеристики оптической активности чаще всего используют d-10-пропиламмниевую соль камфорсульфоновой кислоты (КСК), водный раствор которой обладает КД положительного знака при λ = = 290.5 нм и отрицательного знака при λ = = 192.2 нм, и d-10-камфорсульфонат с практически теми же характеристиками, а также

Наносенс

Длина волны, нм

Рис. 2. П ол ож е ни е а номальной полос ы К Д ХЖК Д Д НК отри ц ат е л ьн ого зна к а , п ол ос КД КСК и Наносен с а ( п ол ожит е льного з н а к а) в обла с ти 30 0 нм и аномальных полос КД отрицательного знака (пункт и рные л и н ии) мол е к у лярных и н ан о -конструкций (НаК) ДНК с разными интеркаля-торам и , в страи в аемыми в их структуру, в области 500 нм.

Видно, что спектр КД Наносенса хорошо "накладывается" на положение полос КД в обеих областях спектра иодид трис(этилендиамин)кобальта(III) моногидрата, водный раствор которого генерирует полосу КД с максимумом при 490 нм [3].

Для тестирования и калибровки оптической ак- тивности биодатчиков на основе ДНК предлагалось использовать также полимерные материалы на основе вышеупомянутых наноконструкций ДНК, включенных в состав полимерного гидроге- ля [4]. Существенным недостатком, препятствующим использованию таких материалов для калибровки дихрометров, остается сложность их изготовления: по этой причине они могут быть доступны пока только узким специалистам, профессионально работающим с НаК ДНК и полимерными гелями.

В настоящей работе предлагается рассмотреть в качестве вторичного стандарта оптической активности в области длин волн, на которых работают дихрометры биосенсорных устройств, разработанный в НИОПИК препарат Наносенс, имеющий характерные рабочие линии в спектре КД одновременно как в ультрафиолетовой, так и в видимой областях спектра (рис. 1), которые стабильны и могут воспроизводить характеристику оптической активности в течение длительного периода (более трех лет).

НАНОСЕНС И ЕГО ОПТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

Наносенс представляет собой стабильную нанодисперсию фталоцианина цинка (средний размер частиц 100–150 нм) — органического красителя (пигмента), практически нерастворимого в воде и органических растворителях, в виде жидкости ярко-синего цвета с содержанием фталоцианина цинка 0.1–0.2 %, поверхностно-активной добавки (Проксанол 268) 0.1–10.0 %, хлорида натрия 0.1–1.5 % и воды (остальное). Химическое название препарата — тетрабензо-5,10,15,20-тетрааза-порфирин цинка. Хранится он в защищенном от света месте при температуре не выше 8 ºС или в замороженном виде при температуре не выше –8 ºС. Основное назначение препарата — лечение злокачественных новообразований методом импульсной лазерной абляции наночастиц [5]. После лазерного облучения некоторая часть фталоцианина цинка, находящегося в опухоли в виде наночастиц и подвергшаяся воздействию лазерного импульса, прямо на месте воздействия излучения испаряется и переходит в молекулярную форму, превращаясь в один из самых эффективных фотосенсибилизаторов для фотодинамической терапии. При дополнительном облучении опухоли непрерывным лазером фотосенсибилизатор генерирует синглетный кислород и перекись водорода, которые поражают клетки опухоли повторно — тем самым реализуется двойное избирательное воздействие на опухоль при однократном введении препарата.

Спектр кругового дихроизма Наносенса (с исходной концентрацией 2 мг/мл) в области 190– 750 нм приведен на рис. 1. Он имеет два выраженных пика: положительный на длине волны 295 нм и отрицательный на длине волны 550 нм. Для сравнения на рис. 2 показаны положения аномаль- ных полос КД комплексов ДНК с интеркалятора-ми (раздельно) дауномицином, порфином, миток-сантроном, сангвиритрином, PicoGreen, SYBR Green, оптическую активность которых и связанную с нею концентрацию требуется контролировать.

НАНОСЕНС КАК ВТОРИЧНЫЙ СТАНДАРТ ОПТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

Предпосылки

Решение поставленной задачи состоит в определении и контроле характеристик оптической активности Наносенса при помощи первичного эталона (водный раствор КСК) и поверки характеристик КД дихрометров биосенсорных устройств на основе ДНК при их работе в УФ и видимом диапазонах длин волн по аттестованным характеристикам оптической активности Наносенса. В данной работе все измерения выполнялись на спектрометре кругового дихроизма (дихромет-ре) СКД-2МУФ, входящем в состав биосенсорной аналитической системы, в которой в качестве биодатчика используются "жидкие" частицы ХЖКД комплексов ДНК с интеркаляторами.

Решению задачи, как следует из сказанного выше, способствуют:

• •    наличие аномальной положительной полосы в спектре КД Наносенса на длине волны 295 нм;

• •    стабильность амплитуды и положения этой полосы при установленной концентрации раствора препарата;

• •    близость указанной полосы Наносенса в УФ-области к полосе КД положительного знака на 290.5 нм первичного эталона — водного раствора КСК;

• •    наличие дополнительной оптической активности Наносенса, проявляемой в виде отрицательной полосы в спектре его КД на длине волны 550 нм, располагаемой в области аномальных полос КД "жидких" частиц ХЖКД комплексов ДНК с интеркаляторами;

• •    наличие для Наносенса при соблюдении фиксированных условий его разбавления определенного соотношения между амплитудой интенсивной положительной полосы в спектре КД в УФ-области (295 нм) и амплитудой отрицательной полосы в видимом диапазоне (550 нм);

• •    долговременная стабильность оптических характеристик Наносенса.

Калибровка дихрометров по величине оптической активности Наносенса реализуется в три этапа.

Этап 1 калибровки

На этапе 1 определяется величина оптической активности на длине волны 295 нм (Δ А НС, 295 ) стандартного раствора Наносенса (2 мг/мл), содержащего распределенные по объему наночастицы фталоцианина. Для ее определения используются близость полос КД и наблюдаемое при измерениях соотношение k 1 между величинами (амплитудами) регистрируемых дихрометром положительного сигнала КД раствора эталона (КСК) на длине волны 290.5 нм (^КДΔ A 290 ), соответствующего [3] известной величине эталонной оптической активности раствора КСК (Δ А эталон ), и положительного сигнала КД раствора Наносенса с максимумом ^КДΔ A 295 на длине волны 295 нм.

Cпектрометр КД измеряет отношение переменной составляющей сигнала на частоте модуляции круговой поляризации излучения (с длиной волны λ ), пропорциональной величине кругового дихроизма Δ А λ ( Δ А λ = ( A R – А L ) λ — разность поглощения А λ в веществе света с правой и левой круговыми поляризациями), к постоянной составляющей регистрируемого сигнала, пропорциональной средней величине светового потока I λ . При этом переменная составляющая величины измеряемого на выходе фотоприемника сигнала КД Δ U λ = Δ I λ × × S λ × T λ , а постоянная (не модулированная) составляющая U 0 = I λ × S λ ( S λ — чувствительность фотоприемника, T λ — величина усиления электронного тракта спектрометра КД), из чего следует Δ U λ = (Δ I λ / I λ ) × U 0 × T. В этих условиях регистрируемые при измерениях сигналы КД растворов КСК и Наносенса можно записать в виде:

• ^КДΔ A 290 = Δ А КСК, 290 × U 0 ( I 290 × S 290 ) × Т 290

и

• ^КДΔ A 295 = Δ А НС, 295 × U 0 ( I 295 × S 295 ) × T 295 .

С учетом одинакового значения усиления электронного тракта Т для двух близких длин волн (290.5 и 295 нм) находим из приведенных выше выражений искомое значение Δ А НС, 295 КД раствора Наносенса (толщиной L ) на основе наночастиц фталоцианина цинка на длине волны 295 нм:

Δ А НС, 295 = k 1 ( A L – A R ) КСК, 290 = k 1 Δ ε КСК, 290 С КСК, М L .

Здесь круговой дихроизм водного раствора КСК Δ ε КСК, 290 = 2.37 М ^–1 см ^–1 и является эталонной величиной для КСК на длине волны 290.5 нм , концентрация С КСК, М выражена в М/л и длина оптического пути L — в см [3].

Для калибровки используются водные растворы КСК, имеющие концентрацию 3, 15, 150 мкг/мл, с оптической плотностью соответственно 31 × 10–6, 154 × 10–6 и 1544 × 10–6 оптических единиц (о.е.) и растворы Наносенса с такой же концентрацией. Исходя из измеренной величи- ны сигнала КД раствора Наносенса на длине волны 295 нм, находим, что оптической плотности раствора Наносенса ΔАНС, 295 = 150 × 10–6 о.е. соответствует концентрация КСК в растворе СКСК = = 6.5 × 10–5 М/л (при длине оптического пути в кювете L = 1 см). Это означает, что при помощи спектрометра КД, откалиброванного согласно описанной выше процедуре измерений и ставшего в результате этого рабочим средством измерения КД, можно проводить тестирование и определение величины сигнала КД любого другого оптически активного соединения или материала при облучении его циркулярно-поляризованным светом вблизи 295 нм, исходя из соотношения регистрируемых спектрометром КД сигналов КД этого соединения (материала) и дополнительного стандарта — раствора Наносенса (КДΔA295).

Этап 2 калибровки

На этапе 2 определяется величина Δ А НС, 537 кругового дихроизма раствора Наносенса в видимой области. При определении этой величины используем, во-первых, определенную на этапе 1 величину оптической активности на длине волны 295 нм (Δ А НС, 295 ) раствора Наносенса и, во-вторых, измеренное соотношение k 2 максимума сигнала КД Наносенса на длине волны 295 нм (^КДΔ A ₂₉₅) и наблюдаемого минимума его сигнала КД в видимой области на длине волны 550 нм:

Δ А НС, 550 = k 2 × Δ А НС, 295 × Т 295 / T 550

(здесь Т 295 и T 550 — измеряемые характеристики усиления Т λ электронного тракта дихрометра в фиксированной полосе частот на указанных выше длинах волн).

Этап 3 калибровки

На этапе 3 полученные на дихрометре характеристики КД дополнительного стандарта на основе раствора Наносенса на длине волны 550 нм используются непосредственно для калибровки в видимой области оптической активности образцов, имеющих в своем составе "жидкие" частицы ХЖКД комплексов "ДНК + интеркалятор" (рис. 2). Задача определения величины (^КДΔ A ДНК+БАС, вид ) решается аналогично решенной на этапе 1, т. е. путем непосредственного измерения соотношения k i сигналов КД Δ А НС , 550 и сигналов КД в видимой области спектра образцов, содержащих тот или иной ( i -й) комплекс "ДНК + интеркалятор", например, "ДНК-SYBR Green", при этом используется близость их полос КД ( Т 550 ~ T 500 ). Аналогичным образом могут быть получены результаты измерения КД других образцов, содержащих комплексы "ДНК-PicoGreen", "ДНК-сангвиритрин", "ДНК-дауномицин", "ДНК-митоксантрон".

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведение описанных выше измерительных процедур означает, что при помощи дихрометра, откалиброванного таким образом и ставшего рабочим средством измерения КД на длине волны 295 и 550 нм, можно проводить определение оптической активности любого другого обладающего этим свойством соединения при облучении его циркулярно поляризованным светом, исходя из соотношения регистрируемых дихрометром сигналов КД от этого соединения (материала) и от вторичного стандарта на основе раствора Наносенса.

Рассмотренный способ калибровки спектрометров кругового дихроизма (поверки измерительной системы спектрометра КД), входящих в состав биосенсорных систем на основе ДНК-биодатчиков, с применением в качестве дополнительного стандарта оптической активности (кругового дихроизма) растворов препарата Наносенс, содержащих наночастицы фталоцианина цинка, может найти применение в спектральном приборостроении и аналитической биохимии, в том числе клинической биохимии.