Направления использования нанотехнологий в сельском хозяйстве. Доклад на I международной научнопрактической конференции «Современные тенденции в селекции и семеноводстве овощных культур. Традиции и перспективы», ВНИИССОК, август 2008 года

Приставка нано- означает одну миллиардную (10-9) чего-либо, т.е. нанотехнология имеет дело с разнообразными структурами вещества, характерный размер которых порядка миллиардных долей метра. Хотя слово «нанотехнология» относительно новое, устройства и структуры нанометровых размеров не новы. История и перспективы наноразработок, которые выполняются в рамках Европейской программы по нанотехнологиям, представлены на рис.1 .

По прогнозу Национального фонда науки США, к 2015 году годовой оборот рынка наноиндустрии достигнет 1 триллиона долларов. В процентном соотношении облик такого рынка прогнозируется следующим образом (табл. 1, .

Рис. 2. Появление разработок новых микроскопов, с вязанных с изобретением атомно-силового микроскопа .

Рис. 1. История и перспективы развития нанобиотехнологий .

f fjpLRt xa ^а»л41л pxpeuiooKrtiMioiMl фатом*» и мслегупярные перекпктчатепи и память

^hW.'-W-^lte. OtMQI МХИ Hl YEWp^MA НМ9ф«^ЫЯ фмеягамслероые ««китем» дм *'|»ес>сдиы» мзнструбое

•—- - - ^ф мегуостхяим мы«рлАи ю цвпоше* Д>*1 -:ф ^ молекулярные млнсгоры (anainvtr О) —— Щ|бмо*«жем8рмые вир/сы и баиt^ent

ф открыты

Оксм^ерческое испо ль зовах* ф ►*••<»* aMihw** г«етермамг

1 44.tl *•■»<.•»• «ЕЮ |С*<МьЭС«31М цессов для создания веществ с желательными свойствами), биоинженерия нуклеиновых кислот (использование ДНК в качестве блоков для формирования наночастиц или использования наночастиц для генной инженерии), адресовка веществ (использование наноматериаловдля адресной доставки веществ к клеткам-мишеням у животных), моделирование (использование нанотехнологий для построения моделей наноматериалов и их применения в слож-

Предполагаемое распределение рынка наноиндустрии к 2015 году

Направления наноиндустрии	Доли рынка,%
Наноэлектроника	40 - 45
Наноматериалы	30 - 35
Нанобиотехнологии	9 - 14
Полимеры	8 - 12
Наноэлектрохимия	3 - 5
Нанооптика	2 - 4

ных системах).

По направлению исследований выделяются следующие проекты использования нанотехнологий:

– биосенсоры – контроль биологических процессов или биомолекул или определение биомолекул, биохимических процессов или организмов;

– защита окружающей среды ( зеленая» инженерия) – изучение состояния окружающей среды,удаление загрязнителей или уменьшение отходов, включает также изучение средовых эффектов наноматериалов;

– устойчивое сельское хозяйство – уменьшение его разрушающего действия на окружающую среду, качество питьевой воды, а такжедля получения конечной продукции менее энергоемким путем;

– определение патогенов в окружающей среде, организмах животных и растений, кормах, конечной сельскохозяйственной продукции;

– селекционная работа в растениеводстве (включая методы трансгеноза или клонирования), повышение устойчивости растений к биотическим (сорняки, болезни, вредители, высокие температуры, заморозки, засухи ит.д.) и абиотическим (обработки пестицидами) стрессорам;

• –    использование растений (рапс, кукуруза, подсолнечник, сахарный тростник и других) для получения биотоплива;

• –    низкотемпературная досушка с обеззараживанием зерна и плодов;

• –    ветеринария – улучшение здоровья животных, повышение безопасности пищевой животноводческой продукции, формирование оптимального микроклимата;

• –    пищевая промышленность – повышение питательной ценности продуктов, совершенствование технологий переработки пищевого сырья и улучшение качества пищевых продуктов, обеспечение потребностей диетического питания, а также методы ультрафильтрации, позволяющие управлять цветом, ароматом и другими свойствами конечной продукции;

• –    нанобиопромышленные продукты – получение продуктов, необходимых промышленности (например, энергоисточники) из сельскохозяйственного сырья или отходов сельского хозяйства;

• –    сельскохозяйственная техника – на-нопорошковые материалы, повышающие ресурсы машин (увеличение стойкости к температуре, влаге, износу и т.д.); упрочнение режущих элементов; нанодобавки к шинам, маслам; уменьшение вредных выбросов;

  – наноэлектробиотехника – модификация биологических и физиологических процессов на уровне клетки с помощью наночастиц за счет воздействия электронов, протонов, ионов, фотонов; направленное влияние оптического излучения (УФ) на

сельскохозяйственные объекты;

– наномембраны и пленки – светотрансформирующие пленки, мембраны для очистки воздуха и воды, опреснения морской воды; пленки с наночастицами серебра для бактерицидных фильтров, в том числе для молочной промышленности, а также как элемент упаковочного материала; использование силатранов, кремнийоргани-ческих биостимуляторов; разработка самоочищающихся кремниевых мембран.

Объем современных ежегодных инвестиций в реализацию третьей научно-технической революции можно оценить в 20-50 млрд. долл. Ожидается, что именно ее достижения и будут лежать в основе устойчивого развития, декларировавшегося на Всемирной встрече на высшем уровне, проведенной под эгидой ООН в Иоганнес-бурге (ЮАР) 26 августа – 4 сентября 2002 года. Принятая на этом саммите Декларация глав государств заканчивалась словами: «Мы торжественно обязуемся перед народами мира и перед поколениями, которые неизбежно унаследуют нашу Землю, решительно действовать для обеспечения того, чтобы наша общая надежда на устойчивое развитие сбылась».

Нанобиотехнология – особая область нанонауки и наноинженерии, применяющая методы и подходы нанотехнологий для создания устройств с использованием биологических макромолекул в целях изучения или управления биологическими системами. Нанобиотехнология использует способность биомолекул к самосборке в наноструктуры. Так, например, липиды способны спонтанно объединяться и формировать жидкие кристаллы. ДНК используется не только для создания наноструктур, но и в качестве важного компонента наномеханизмов. Предполагается, что ДНК может стать основным компонентом компьютеров следующего поколения. Вместо того, чтобы создавать кремниевую основу микросхемы, нанотехнологи смогут использовать двухцепочечную молекулу ДНК, которая представляет собой натуральный каркас для создания наноструктур, а ее способность к высокоспецифичному связыванию позволяет объединять атомы в предсказуемой последовательности, необходимой для создания наноструктуры. Так, например, Пол Ротмунд разработал методы создания двумерных структур с заданными формами на основе ДНК (автор назвал их «оригами ). Основные приоритеты развития нанобиотехнологий определяют по следующим направлениям: создание биологических наночипов для диагностики соматических и инфекционных заболеваний, в том числе для видовой идентификации возбудителей особо опасных инфекций и токсинов; наночастицы как лекарственные препараты нового поколения, а также как контейнеры для адресной доставки лекарств в клетки-мишени; медицинские нанороботы, способные устранять дефекты в больном организме путем управляемых нанохирургических вмешательств; молекулярные детекторы для секвенирования генома на основе неорганических нанопор; самораз-множающиеся геномы, применимые в области биотехнологии с целью производства лекарств, проведения фармакологического скрининга и моделирования патологических процессов; биосовместимые наноматериалы широкого спектра применения (в том числе для создания искусственных органов, принципиально новых типов материалов с антимикробной, противовирусной и противовоспалительной активностью); миниатюризация биосенсоров путем объединения биологического и электронного компонентов в один прибор – биоблоки; использование новых (модифицированных) ферментов для развития экологически чистых производственных процессов ( зеленая» инженерия).

Качественно новые возможности в отношении транспорта и доставки разных веществ появились с открытием фуллерена 60, который обладает рядом уникальных свойств. Кроме хорошо известных электрофизических, оптических, адсорбционных и других полезных технических свойств фуллерена, особое место занимает возможность его применения в биологической и медицинской химии. Разнообразие технологий производства фуллеренов и их производных позволяет планировать существенное расширение спектра применения наночастиц как лекарств, создание математических моделей для прогнозирования биологической активности, формулирование требований к производственным технологиям и в итоге получение наночастиц с заданными лекарственными свойствами.

Разработаны углеродные нанотрубки – протяженные цилиндрические углеродные структуры диаметром от 1 до нескольких десятков нм и длиной до нескольких сантиметров, которые состоят из одной или нескольких свернутых в трубку гексагональных углеродных структур и заканчиваются обычно полусферической головкой. Благодаря методам получения углеродных нанотрубок различной формы и модификаций, создаются новые методы работы с живыми объектами в нанометровом масштабе, такие как нанопинцеты, нанопипетки.

Особое значение нанотехнологии имеют для развития сравнительно новой области исследований – геномики. Развитие методов нанобиотехнологий – работ с последовательностями ДНК в нанометровом масштабе – позволили появиться таким новым направлениям, как геномика, позо-ляющим сравнивать полиморфизм геномов. Структурная геномика оценивает, в частности, геномное разнообразие, функциональная – профили экспрессии различных генетических элементов. Геномика предполагает, в том числе, внутривидовое и внутрипопуляционное сравнение геномов.

Использование ДНК-биочипов позволило обнаружить множественные моно-нуклеотидные сайты полиморфизма (SNP), создать карты их распространения вдоль геномов, выявить сегментные дупликации и выделить наиболее консервативные участки ДНК в некодирующих геномных последовательностях (Харченко, Глазко, 2006).

В то же время, в отличие от точковых мутаций, сегментных дупликаций, анализ распределения инвертированных повто- ров позволяет оценивать особенности взаимного позиционирования нуклеотидных последовательностей, способных к участию в формировании вторичных структур ДНК, необходимых, в частности, для опознавания регуляторных сигналов.

Очевидно, что инвертированные повторы объединяют гетерогенную по структурно-функциональным характеристикам группу нуклеотидных последовательностей, для которых, по-видимому, невозможно обнаружить некоторые универсальные черты внутригеномного распределения.

В наших исследованиях полиморфизма фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными декануклеотидами (RAPD-PCR), на геномной ДНК сортов ячменя, а также разных видов млекопитающих были получены следующие данные. Полилокус-ные спектры RAPD-PCR зависят от нуклеотидной последовательности декануклеотида; распределение инвертированных декануклеотидных повторов для отдельных видов и таксонов имеет выраженные таксон-специфичные черты; спектры продуктов амплификации, в основном, определяются шестью нуклеотидами на 3' конце; отмечается широкая изменчивость динамики накопления продуктов амплификации с разных участков генома при одних и тех же условиях ПЦР.

Выполнен анализ распределения потенциальных сайтов отжига декануклеотидов UBC-85 и UBC-126 (RAPD-PCR) в сек-венированных последовательностях различных таксонов (Глазко и др., 1997).

Наибольшее количество ампликонов при поисках полного совпадения с UBC-85 выявляется у вирусов (57) и прокариот (75); к UBC-126 – у грибов (19), прокариот (20) и беспозвоночных (15). Наименьшее количество выявлено по UBC-85 у человека (3), грызунов (4), позвоночных (3) и растений (6); по UBC-126 – у человека (5), грызунов (1), позвоночных (2), растений (6) и млекопитающих (0).

Для таких таксонов, как человек, грызуны, другие млекопитающие, позвоночные, растения некоторые длины ампликонов являются «перепредставленными» по сравнению с другими.

У беспозвоночных, вирусов и прокариот распределение частот встречаемости ампликонов разной длины относительно более равномерно. Тем не менее, спектр потенциальных ампликонов у вирусов, полученный с использованием UBC-85 (252 ампликона), существенно отличается от выявляемого при использовании UBC-126 (38 ампликонов).

Полученные данные свидетельствуют о наличии определенной неслучайности распределения сайтов узнавания декануклеотидов – специфичности спектра ампликонов в зависимости от используемого праймера и исследуемого таксона.

В исследованиях на геномах сортов и близкородственных видах сои, сортов пшениц выявлен широкий размах изменчивости в спектрах продуктов амплификации при использовании в качестве праймера фрагментов микросателлитных локусов с различными коровыми последовательностями (ISSR-PCR).

Обращает на себя внимание высокая точность воспроизводства спектров ампликонов, полученных таким образом: обнаруживаются выраженные отличия между спектрами в случае использования в качестве праймера одного и того же корового микросателлитного мотива, но с разными «якорными» нуклеотидами, а также в случае мотива, сдвинутого на один нуклеотид или комплементарного ему. Это свиде- тельствует о достаточно высокой точности идентификации флангов амплифицируе-мых фрагментов ДНК (Глазко и др., 1999).

Наибольшее количество продуктов амплификации у разных видов получается при использовании в качестве праймеров фрагментов пурин/ пиримидиновых последовательностей (ди-, тринуклеотидные микросателлиты GA, АG, GAG, CTC). Для участков ДНК, фланкированных такими инвертированными повторами, отмечается и наибольший консерватизм по длинам продуктов амплификации, полученным на геномной ДНК различных видов.

Два динуклеотидных мотива – (GA)9C и (CA)9G в базе данных nr для Arabidopsis thaliana отличались тем, что первый встречался с существенно большей частотой, чем второй, при этом 38% от общего числа сайтов гомологии локализована в транслируемых последовательностях dbEST – то есть, лидерных последовательностях и экзонах.

Иное распределение обнаруживается по сайтам гомологии к микросателлиту (CA)9G – их частота встречаемости почти в четыре раза ниже в геноме данного вида, чем первого динуклеотида, и только 10% от общего числа сайтов локализовано в транслируемых районах (Глазко и др., 1999).

Накопленные данные свидетельствуют о наличии неслучайности в распределении фрагментов ДНК, фланкированных инвертированным повтором участка микросател-литного локуса в зависимости от его нуклеотидной последовательности и принадлежности к пурин/пиримидиновым трекам.

Известно, что микросателлитные локусы с относительно повышенной частотой позиционированы в геноме с последовательностями ретротранспозонов. Для выяснения этого вопроса на сортах овса были выполнены сравнения полилокусных спектров, полученных с использованием одного праймера – фрагмента микросателлитного локуса, и двух, когда один праймер был тот же, а второй – фрагмент терминальной последовательности ретротранспозона (Календарь, Глазко, 2002). Оказалось, что спектры, полученные с использованием двух праймеров, существенно более обогащены продуктами амплификации, чем при амплификации фрагментов ДНК, фланкированных только инвертированным повтором микросателлита.

То есть, экспериментально было показано, что близкое расположение микросателлита и ретротранспозона встречается чаще, чем антипараллельные микросател-литные локусы.

Анализ распределения длин участков ДНК, фланкированных инвертированными повторами терминальных участков ретротранспозонов у сортов риса, пшеницы также свидетельствует об отсутствии равновероятного рассеивания таких фрагментов по длине генома.

Накопленные данные позволяют ожидать, что наиболее полиморфным вариантом молекулярно-генетических маркеров, удобных для решения ряда прикладных задач в исследованиях генофонда культурных растений, могут быть маркеры, основанные на оценке полиморфизма участков ДНК, связанных с транспозирующими элементами.

Таким образом, накопленные данные о распределении различных вариантов инвертированных повторов свидетельствуют об их внутригеномной организованности.

Такая организованность согласуется с наблюдениями Лима де Фария о неслучайности чередования гетерохроматиновых блоков по длине хромосом у ряда расти- тельных видов, позволившая ему сформулировать гипотезу о «хромосомных полях», благодаря которым нуклеотидные последовательности и скопление различных семейств повторов, включая центромерные и теломерные, непосредственно связаны с морфологией хромосом.

В последние годы накоплено много данных, свидетельствующих в пользу представлений Антонио Лима де Фариа о тесной связи между молекулярной структурой материала наследственности и морфологией хромосом, тем, что Лима де Фа-рия называл «хромосомным фенотипом». К таким данным относятся факты неслучайного распределения ретротранспозонов по длине хромосом Arabidopsis (Kendal, Suomela, 2005), а также ряда видов грибов; неслучайная локализация семейств ретротранспозонов в центромерных районах некоторых видов растений, в частности, кукурузы (Jin et al., 2005), локализация ретротранспозонов в теломерных районах хромосом.

В представления о взаимной детерминированности микро- и наноуровней организации генетического материала хорошо укладываются данные об участии механизмов ретровирусной экспансии в возникновении самой линейной хромосомы эукариот, еете-ломерных и центромерных структур.

В этой связи, очевидно, что оценки геномных полиморфизмов должны выполняться с учетом принадлежности молекулярно-генетических маркеров к семействам различных геномных элементов, имеющих неслучайное распределение по длине хромосом, структурно-функциональную организацию, а также закономерности консервативности/ полиморфизма и эволюции. Использование для генофонд-ных исследований только определенных типов молекулярно-генетических маркеров может приводить к существенному искажению результатов генофондных сравнений при экстраполяции получаемых данных на геномную изменчивость.