Натуральные киллеры в иммунотерапии онкологических заболеваний

Злокачественные новообразования находятся на втором месте (15,5 %) в структуре смертности после заболеваний сердечно-сосудистой системы. Недостаточная эффективность традиционных методов лечения обусловлена не только поздней диагностикой, но и резистентностью отдельных форм злокачественных новообразований к проводимым схемам системной терапии. Около 40 % злокачественных новообразований диагностируются на III–IV стадиях, более 90 % пациентов погибают от метастатического поражения отдаленных органов [1]. В связи с этим возникает необходимость в разработке современных методов терапии, позволяющих с одинаковой эффективностью бороться как с клетками первичного опухолевого очага, так и с циркулирующими в периферической крови, которые являются источниками отдаленных метастазов.

За последние десятилетия существенный прогресс достигнут в области иммунотерапии, которая выступает в качестве четвертой модальности в лечении онкологических заболеваний, наряду с хирургическим лечением, лучевой и химиотерапией. Были разработаны многочисленные иммунотерапевтические стратегии, продемонстрировавшие свою безопасность и эффективность в ряде клинических испытаний. Иммунотерапия в настоящий момент включает такие направления, как создание ингибиторов контрольных путей, нативные и конъюгированные с химиопрепаратами или радиоактивными частицами антитела, противоопухолевые вакцины, а также адоптивная клеточная терапия. Настоящий прорыв был совершен в онкогематологии, связанный с разработкой и внедрением в клиническую практику препаратов на основе Т-лимфоцитов, несущих химерные рецепторы антигена (CAR). Несмотря на достигнутые успехи, метод имеет определенные ограничения в терапии солидных опухолей, обусловленные серьезными побочными эффектами. Наиболее перспективной в этом отношении выглядит стратегия использования эффекторных клеток врожденного иммунитета, в частности натуральных киллеров (НК), обладающих высоким противоопухолевым потенциалом. Полученные результаты многочисленных исследований позволяют оценить безопасность и эффективность терапии на основе НК-клеток.

Статья посвящена описанию природы натуральных киллеров, их функциональных особенностей и роли в противоопухолевом иммунитете, кроме того, в ней рассмотрены основные стратегии использования НК-клеток в иммунотерапии злокачественных новообразований.

Основные свойства и функции натуральных киллеров

Натуральные киллеры, впервые описанные в 1975 г., представлены популяцией крупных гранулярных клеток костно-мозгового происхождения. Основным компонентом гранул натуральных киллеров являются белки перфорин и гранзим В. Среди клеток периферической крови 15 % приходится на долю НК-клеток с фенотипом CD 56dim CD 16+, обладающих наибольшей цитотоксической активностью, в то время как в печени, лимфоузлах и миндалинах локализованы натуральные киллеры с фенотипом CD 56bright CD 16dim, продуцирующие интерферон-гамма (ИФН-γ) и выполняющие преимущественно регуляторную функцию. Фенотипическое разнообразие НК-клеток в организме определяется присутствующими на поверхности многочисленными активирующими и ингибиторными рецепторами. К ним относятся ингибиторные иммуноглобулин-подобные рецепторы (KIR) (KIR-2DL и KIR-3DL) и B1(LILRB1), активирующие рецепторы естественной цитотоксичности (NCR) (NKp46, NKp30 и NKp44). На поверхности НК-клеток также экспрессируются цитотоксические (CD94/NKG2C, NKG2D, NKG2E/H и NKG2F) и ингибиторные (CD94/NKG2A/B) рецепторы класса лектинов С-типа и др. Процесс созревания НК-клеток ассоциирован с изменением экспрессии некоторых поверхностных рецепторов. Наличие на мембране рецептора NKG2А характерно для незрелых НК-клеток, в то время как маркер CD57 появляется преимущественно на терминальных стадиях дифференцировки [2]. Индукция созревания натуральных киллеров происходит под влиянием провоспалительных цитокинов в условиях формирования иммунного ответа. При этом сигналы от активационных и ингибиторных поверхностных рецепторов обеспечивают оптимальную функциональную активность НК-клеток.

Важной особенностью натуральных киллеров, отличающей их от клеток адаптивного иммуни- тета, является способность распознавать раковые антигены без участия молекул главного комплекса гистосовместимости (MHC). Кроме того, натуральные киллеры способны узнавать и проявлять цитотоксическую активность по отношению к собственным клеткам организма, на мембране которых отмечается низкий уровень экспрессии молекул MHC Ι класса. Снижение уровня экспрессии молекул MHC Ι класса, как правило, является сигналом, свидетельствующим о повреждении клетки или злокачественном перерождении. Благодаря наличию свойства распознавать измененные собственные клетки организма естественные киллеры играют одну из ключевых ролей в осуществлении противоопухолевого надзора [2–5]. Исследование противоопухолевой активности натуральных киллеров подтвердило наличие у них способности вызывать гибель опухолевых клеток как in vitro, так и in vivo [6, 7].

Противоопухолевый потенциал натуральных киллеров реализуется с участием нескольких механизмов. Одним из таких механизмов является продукция перфорина и гранзима В, индуцирующих апоптоз в клетках-мишенях. Для НК-клеток также характерно наличие способности вызывать рецептор-опосредованный апоптоз с помощью продукции белков FasL (Fas ligand) и TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand). Помимо этого, натуральные киллеры продуцируют оксид азота, вызывающий нарушение метаболических процессов и гибель раковых клеток. Непрямая противоопухолевая активность НК-клеток реализуется с помощью секрециии ИФН-γ, фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-α), гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ), регулирующих процесс Т-клеточного иммунного ответа [8].

Рецепторы, присутствующие на поверхности натуральных киллеров, играют ключевую роль в осуществлении противоопухолевого надзора. К ним относятся трансмембранный белок NKG2D (Natural Killer Group 2D), узнающий секретируемые раковыми клетками белков «стресса» MHC-ассоциированная последовательность-А (MICA) и MHC-ассоциированная последовательность-В (MICB), которые, как правило, слабо экспрессируются в нормальных клетках [9, 10]. В результате повреждения уровень продукции MICA и MICB в клетке существенно повышается. Проведенные исследования показали высокий уровень продукции MICA и MICB клетками меланомы, гепатоцеллюлярной карциномы и др. [11]. Помимо этого, могут встречаться растворимые формы MICA/B, образующиеся в результате слущивания с поверхности опухолевой клетки и накапливающиеся в крови. Растворимые формы MICA/B могут связываться с NKG2D рецептором, блокируя цитотоксическую активность НК клеток. Другим рецептором, рас- познающим сигналы с поверхности поврежденной клетки, является DNAM-1 (DNAX Accessory Molecule-1). Активация рецептора DNAM-1 приводит к индукции цитотоксической и ИФН-γ продуцирующей активности. Помимо этого, на поверхности натуральных киллеров присутствуют рецепторы FcγRIIIA и FcγRIIC к Fc фрагменту антител, опосредующие антител-зависимую клеточную цитотоксичность (АЗКЦ). Модуляция сигналов с поверхностных рецепторов позволяет регулировать функциональную активность НК-клеток [6, 12–14].

НК-клетки памяти

В настоящее время существует понятие иммунологической памяти для НК-клеток, наделенных свойствами клеток адаптивного иммунитета и обладающих способностью распознавать и элиминировать патогены в ответ на их повторное попадание в организм. Впервые идея о существовании НК-клеток памяти появилась в 2006 г. в исследованиях, проведенных на модели мышей, лишенных Т- и В-лимфоцитов, которым вводили гаптены (2,4-динитрофлуоробензин и оксазолон). Повторное введение гаптенов приводило к формированию более выраженного иммунного ответа за счет присутствия НК-клеток памяти [15, 16]. Первичным местом локализации НК-клетки памяти на начальных этапах считалась печень. В результате дальнейших исследований NK-клетки памяти были обнаружены в селезенке, легких, почках и других лимфоидных органах, а также свободно циркулирующие в периферической крови [17, 18]. В настоящее время описаны несколько популяций естественных киллеров, обладающих признаками иммунологической памяти. Образование первой популяции антиген-специфических НК-клеток происходит в результате контакта с вирусами или гаптенами. Другая популяция НК-клеток памяти образуется под влиянием провоспалительных цитокинов и является инструментом неспецифического иммунного ответа. В последнее время рассматривается потенциальная возможность использования таких клеток для иммунотерапии онкологических заболеваний. Фактически НК-клетки памяти можно характеризовать как клетки, обладающие высоким уровнем цитотоксической активности. В системе in vitro получение клеток, обладающих подобными характеристиками, возможно при создании оптимальных условий культивирования с использованием коктейля ростовых факторов, активирующих пролиферативную и цитотоксическую активность естественных киллеров [19].

Возможности использования натуральных киллеров для иммунотерапии онкологических заболеваний

Высокий противоопухолевый потенциал естественных киллеров делает их привлекательным инструментом в лечении злокачественных новообразований. Первые попытки лечения злокачественных новообразований с использованием НК-клеток были предприняты научным коллективом под руководством S.A. Rosenberg в Национальном институте рака [20]. Получены результаты клинических испытаний, доказывающих безопасность и эффективность применения натуральных киллеров. Кроме того, технология с использованием НК-клеток обладает существенными преимуществами по сравнению с адаптивной иммунотерапией на основе Т-лимфоцитов. Дело в том, что при введении НК-клеток фактически исключается возможность развития реакции «трансплантат против хозяина». Кроме того, НК-клетки не обладают выраженной цитотоксической активностью по отношению к нормальным клеткам органов и тканей (печени, легких, почек, мышечной ткани и др.), что, в свою очередь, снижает уровень риска развития побочных эффектов от проводимой терапии. Результаты клинических исследований показали, что при использовании НК-клеток практически не наблюдаются побочные эффекты, обусловленные реакцией «трансплантат против хозяина» в сравнении с иммунотерапией на основе активированных Т-лимфоцитов. Небольшая продолжительность жизни активированных НК-клеток и наличие поверхностных ингибиторных рецепторов, модулирующих функциональную активность, также вносят вклад в снижение рисков развития побочных эффектов от иммунотерапии.

Тем не менее, несмотря на видимые преимущества и перспективность, технология на основе НК-клеток не получила широкого применения. Существенным препятствием в этом являются трудоемкость и значительные финансовые затраты, связанные с получением натуральных киллеров в достаточном количестве. Помимо этого, существуют определенные трудности, возникающие при использовании аутологичных НК-клеток, обусловленные качественным и количественным дефектом популяции натуральных киллеров периферической крови онкологических больных. В связи с этим терапевтические подходы могут быть направлены на модуляцию вышеописанных дефектов как in vivo, так и in vitro [21].

Аутологичные НК-клетки

Технология на основе аутологичных НК-клеток представляет собой метод выделения НК клеток самого больного с целью их дальнейшей активации в системе ex vivo в присутствии цитокинов. На начальных этапах исследования было выявлено, что для поддержания активности выделенных из периферической крови НК-клеток в системе ex vivo требуется присутствие в среде для культивирования интерлейкина-2 (ИЛ-2). В таких условиях на 3–5-е сутки культивирования наблюдается увеличение степени экспрессии поверхностных маркеров натуральных киллеров, свидетельствующих об их активации. Было также замечено, что важным фактором, влияющим на жизнеспособность натуральных киллеров в системе ex vivo, является присутствие аутологичных Т-лимфоцитов. В результате проведенных экспериментов было показано, что изолированная популяция НК-клеток периферической крови обладает короткой продолжительностью жизни и низким уровнем цитотоксической активности. При культивировании в тех же условиях смешанной с лимфоцитами популяции клеток уровень жизнеспособности натуральных киллеров существенно повышался [22]. В качестве факторов, индуцирующих пролиферативную и функциональную активность натуральных киллеров, в некоторых случаях используется комбинация ИЛ-2, ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-18 и ИЛ-21. В таких условиях удается получить лимфокин-активированные киллеры (LAK), обладающие высоким уровнем цитотоксической активности [8, 23]. Процесс культивирования НК-клеток ex vivo в присутствии ростовых факторов направлен как на индукцию пролиферативной активности, так и на восстановление оптимального уровня экспрессии поверхностных активирующих рецепторов. Была также отмечена ключевая роль аминокислоты аргинина в процессе созревания натуральных киллеров. Полное отсутствие аминокислоты аргинина в среде для культивирования, как показали результаты исследования, приводило к снижению цитотоксической активности натуральных киллеров на 70 %. При добавлении аргинина функциональная активность НК-клеток восстанавливалась [24]. Примером терапии с использованием аутологичных НК-клеток является Ι фаза клинических испытаний, проведенных с участием пациентов с множественной миеломой. В исследованиях оценивался противоопухолевый эффект терапии, основанной на введении аутологичных активированных ex vivo натуральных киллеров после проведенного курса химиотерапии. Активация аутологичных НК-клеток в этом случае осуществлялась с помощью совместного культивирования с генетически-модифицированной линией клеток K562-mb15-41BBL, обладающей способностью продукции ИЛ-15 и 41BBL(4-1BB ligand), вызывающих активацию и пролиферацию натуральных киллеров. В результате терапии у 4 из 5 пациентов наблюдалась стабилизация процесса, у 2 пациентов был зарегистрирован длительный иммунный ответ [25].

Несмотря на привлекательность метода иммунотерапии на основе аутологичных НК-клеток, клинический эффект от их введения остается неоправданно низким, что, в свою очередь, может быть обусловлено присутствием на поверхности ингибиторных KIR рецепторов, узнающих молекулы MHC Ι класса на опухолевой клетке. Активация KIR рецепторов негативно регулирует цитотоксическую активность натуральных киллеров.

Аллогенные НК-клетки

Обойти проблему, сопряженную с активацией ингибиторных KIR рецепторов, позволяет подход на основе аллогенных НК-клеток. Безопасность и эффективность применения аллогенных НК-клеток была продемонстрирована в клинических испытаниях на различных моделях онкологических заболеваний [26–28]. Так, у больных раком молочной железы наблюдался противоопухолевый эффект после введения аллогенных НК-клеток в комбинации с подкожным введением ИЛ-2. Кроме того, перед введением аллогенных НК-клеток проводился курс химиотерапии с целью увеличения толерантности иммунной системы реципиента к вводимым донорским НК-клеткам. Результаты исследований показали, что уровень иммунного ответа, вызванного введением аллогенных натуральных киллеров, превосходил по интенсивности иммунный ответ, индуцируемый аутологичными НК-клетками (NCT00376805). Другим доказательством эффективности применения аллогенных НК-клеток являются эксперименты, проведенные в группах пациентов с острой миелоидной лейкемией. В этом случае введение аллогенных НК-клеток приводило к увеличению безрецидивной выживаемости в 25 %. В настоящее время успех с применением технологии на основе натуральных киллеров получен в большей степени в онкогематологии. Для этих целей активация НК-клеток ex vivo достигается с помощью их совместного культивирования с линией клеток хронической миелоидной лейкемии K 562. Характерной особенностью линии клеток K 562 является наличие свойства продуцировать IL-15 или IL-21 и 4-1BB [29–31]. В результате проведенных клинических испытаний у пациентов с CD20 позитивной (CD 20+) В-клеточной лимфомой доказана эффективность применения натуральных киллеров, полученных в результате активации в присутствии линии клеток K 562 [32]. Еще одной альтернативой технологии на основе аутологичных НК-клеток является гаплоидентичная трансплантация, в основе которой лежит 50 % тканевая совместимость донора и реципиента. Клинические исследования гаплоидентичной трансплантации были проведены у пациентов с острой миелоидной лейкемией, в результате которых наблюдался специфический противоопухолевый ответ у 26 % больных [28].

Несмотря на доказанный терапевтический эффект введения аллогенных НК-клеток, метод сопряжен с определенными трудностями, вызванными поиском подходящего донора. Кроме того, в большинстве случаев для достижения выраженного терапевтического эффекта требуется многократное введение аллогенных НК-клеток, в связи с чем возникает необходимость получения большого количества аллогенных НК-клеток.

Клетки линии NK-92

Для преодоления ограничений, связанных с трудоемкостью получения достаточного количества активированных ex vivo НК-клеток, была разработана технология с использованием линии клеток NK-92, полученных от пациента со злокачественной неходжкинской лимфомой. Отличительной особенностью линии клеток NK-92 является высокий уровень цитотоксической активности по отношению к раковым клеткам. Противоопухолевая активность клеток линии NK-92 была показана в Ι фазе клинических испытаний у пациентов с почечно-клеточной карциномой и меланомой. Результаты исследований продемонстрировали безопасность использования клеток линии NK-92. Более того, линия NK-92 стала одной из первых эффекторных клеток, одобренных Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA) для иммунотерапии меланомы [33].

Доказательства противоопухолевой активности клеток линии NK-92 были также получены в результате клинических испытаний, проведенных в группах пациентов с меланомой и раком легких [33, 34]. Важным преимуществом клеток линии NK-92 является возможность получения их в достаточном количестве ex vivo, что, в свою очередь, исключает необходимость значительных финансовых затрат. В сравнении с первичными НК-клетками, выделенными из периферической крови, клетки линии NK-92 с большей эффективностью поддаются трансдукции, что дает основания для их широкого использования в области CAR-технологий.

CAR-технологии

CAR-технологии широко применяются для усиления специфической активности эффекторных клеток врожденного и адаптивного иммунитета. Данная платформа базируется на создании клеток, несущих химерный антигенный рецептор, селективно узнающий антигены на поверхности опухолевой клетки. В этом отношении ключевым фактором является выбор оптимальных мишеней – опухолевых антигенов, позволяющих с высокой долей вероятности отличить опухолевую клетку от нормальной.

В ежегодном докладе Американского общества клинической онкологии CAR T-клеточная терапия была названа главным достижением 2017 г. Основанием для этого стало внедрение в клиническую практику препаратов на основе CAR-Т-лимфоцитов, одобренных FDA для лечения гематологических опухолей. Тем не менее, несмотря на достигнутые успехи CAR-T-клеточной терапии в онкогематологии, при терапии солидных опухолей не удалось достичь желаемых результатов. Более того, терапия солидных опухолей CAR Т-лимфоцитами сопряжена с серьезными побочными эффектами [35]. Помимо Т-лимфоцитов, в осно- вы для CAR-технологий используют также клетки врожденного иммунитета, а именно натуральные киллеры. Для получения НК-клеток, содержащих химерный рецептор, как правило, используется клеточная линия NK-92. Первые попытки генетической модификации линии NK-92 были предприняты с целью получения клеток, несущих на поверхности высокоаффинный рецептор FcγRIIIa (CD 16) к Fc фрагменту иммуноглобулинов, принимающий участие в реакции антител-зависимой клеточной цитотоксичности. Результаты ex vivo и in vivo проведенных исследований показали способность генетически модифицированных клеток NK-92, несущих химерный рецептор FcγRIIIa, увеличивать эффективность терапии на основе моноклональных антител (МКА) [36–39]. Использование клеток NK-92, несущих на поверхности высокоаффинный рецептор для Fc фрагмента антител, позволяет существенно повысить уровень антител-зависимой клеточной цитотоксичности и может быть рекомендовано для применения в комбинации с МКА в лечении злокачественных новообразований. Другим примером является получение клеток NK-92, экспрессирующих химерный рецептор к антигену ErbB2/HER2. Такие клетки, как выяснилось в результате исследований, обладали способностью ex vivo и in vivo вызывать гибель опухолевых клеток, экспрессирующих рецептор ErbB2/HER2 [40]. Помимо этого, были предприняты попытки по созданию генетически-модифицированных клеток NK-92, несущих химерный рецептор, специфически узнающий CD19 на поверхности В-лимфоцитов. Эффективность применения таких НК-клеток показана при терапии В-клеточных опухолей [41]. Результаты исследований применения CAR НК-клеток, безусловно, свидетельствуют о перспективности данного направления в лечении онкологических заболеваний.