Нейромедиаторные биогенные амины в структурах костного мозга при аллопересадке

Введение. В организме содержатся биоа- минпродуцирующих клеток, которые оказывают регулирующее действие на клетки и ткани. Среди этих клеток выявляют гранулярные люминесциру-ющие и тучные клетки, содержащие наибольшее количество нейроаминов. Кроме них нейроамины содержатся в адренергических нервных волокнах, мегакариоцитах, липоцитах. Гранулярные люминесцирующие и тучные клетки являются продуцентами нейроаминов. Они способны продуцировать, накапливать и выделять нейроамины [1, 2, 3, 4]. Адренергические нервные волокна содержат катехоламины и серотонин, которые являются результатом синтеза нервных клеток. Липоциты также содержат в большой концентрации нейроамины, но в основном в цитоплазме и их ядре. Данные клетки скорее всего являются адсорбентами и накопителями для этих веществ [2].

В связи с этим, нами в основном изучались данные структуры в костном мозге после аллотрансплантации костного мозга.

Цель исследования - изучение нейроамин-ного обмена в костном мозге при аллопересадке во временном аспекте.

Материал и методы исследования. Опытных животных разделили на 2 серии: 1 - интактные мыши без введения (n=15); 2 - аллогенная пересадка (n=15) – 0,1 мл костного мозга, взятый из бедренной кости мыши помещали в 1 мл 0,9% физиологического раствора и тщательно размешивали. 1 мл суспензии костного мозга вводили в хвостовую вену мыши другой линии. Число клеток в 1 мл суспензии было равно 2,1* 108.

Животные содержались в стандартных условиях вивария со свободным доступом к корму. Мышей выводили из эксперимента через 40 мин и 2 часа после аллопересадки костного мозга, брали костный мозг и изготавливали срезы 5 мкм с последующей обработкой по методу Фалька–Хилларпа в модификации Е.М. Крохиной для выявления катехоламинов и серотонина [5]. Концентрация катехоламинов, серотонина в структурах костного мозга оценивались с помощью ми-крофлуориметрической насадки к люминесцентному микроскопу ФМЭЛ-6 (ЛОМО, Россия). Для определения катехоламинов служил интерферен- ционный фильтр 6 (48О нм), серотонина – 8 (525 нм). Hаблюдение велось при напряжении 8ОО вольт, с диаметром зонда О,5 (условные единицы). Подсчет гранулярных люминесцирующих и тучных клеток производили в 5 полях зрения микроскопа Микромед-2 (ЛОМО, Россия) при увеличении об. 40, ок. 10, диаметр зонда 0,5 мм. Использовался иммуногистохимический метод для выявления антиапоптического белка Bcl2 в структурах костного мозга. Полученные данные обрабатывались с использованием стандартного программного пакета Statistica 6.0 на персональном компьютере Pentium III. Оценку значимости цифровых данных проводили по t-критерию Стьюдента. Различия считали значимыми при P<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение. Через 40 минут в гранулярных люминес-цирующих клетках костного мозга происходит снижение содержания катехоламинов до 8,8±0,1 у.е. (у интактных мышей - 15,6±0,1 у.е.) и серотонина до 9,7±0,1 у.е. (у интактных - 14,1± 0,1 у.е.), наблюдается незначительное увеличение данных нейроаминов в межклеточном пространстве. Аналогичная картина отмечается в тучных клетках. со сниженным содержанием катехоламинов до 10,1±0,2 у.е. (у интактных мышей - 19,6±0,2 у.е.) и серотонина до 11,3±0,4 у.е. (у интактных мышей -21,3±0,4 у.е.). Однако число тучных и гранулярных люминесцирующих клеток остается повышенным до 3 – 4 на поле зрения (у интактных – 1-2 клетки).

Выявляются группы клеток, расположенные в центре размножения, состоящие из макрофага, гранулярной люминесцирующей, тучной клетки, в редких случаях можно выявить липоцит. Вокруг этих клеток-регуляторов располагаются клетки эритроидного ряда, или смешанные: эритроидного и нейтрофильного рядов. И макрофаг, и гранулярная люминесцирующая клетка похожи друг на друга, но отличаются содержанием моноаминов и формой гранул. Нервные волокна слабо визуализируются. Тучные клетки чаще всего выявляются частично дегранулироваными.

Через 2 часа люминесценция межклеточного вещества была увеличена вследствие тотальной дегрануляции тучных клеток. Число тучных и гранулярных люминесцирующих клеток снижается до 1 – 2 клеток на несколько полей зрения. Выявляется распад гранул в гранулярных люминесциру-ющих клетках, имеющие 1-2 люминесцирующие гранулы, а остальные не люминесцировали вследствие отсутствия нейроаминов в них. Содержание катехоламинов в люминесцирующих гранулах было повышенным. Гранулярные люминесциру-ющие и тучные клетки располагаются диффузно, в то время, как у интактных мышей данные клетки располагаются около островков размножения. Отмечается сниженное число гранулярных люми- несцирующих и тучных клеток в костном мозге по сравнению с интактными мышами.

Выявляемость адренергических нервных волокон, при исследовании на катехоламины и серотонин, увеличилась, но они не имели четких очертаний, т.е. произошел выброс нейроаминов из этих структур. Выявлялись, в повышенном числе, округлые клетки со светящимися мелкими гранулами и несветящимся бобовидными ядрами (макрофаги).

Кроме того, наблюдается распад групп клеток, расположенных в центре размножения, которые осуществляют синтез и поддерживают оптимальное содержание нейроаминов в костном мозге.

Экспрессия белка Bcl 2 выявляется в тучных клетках, одни из которых имеют темное ядро, в других оно не определяется. Появляются единичные компактные тучные клетки. Позитивных гранулярных клеток выявляется до 3 (у интактных 5-6), иногда образующие скопления.

Кроме того, экспрессия белка Bcl 2 определяется в некоторых ядрах сегментоядерных нейтрофилов и митотически делящихся клетках (рис. 1). Отмечается сниженное число позитивно экспрессирующих белок мегакариоцитов.

Исходя из вышеизложенных данных можно заключить, что аллопересадка костного мозга существенно влияет на содержание нейроаминов в костном мозге и изменяет внутриклеточные связи. Через 40 минут в гранулярных люминесцирующих и тучных клетках костного мозга отмечается численное снижение нейроаминов с последующей частичной дегрануляцией и накоплением их в межклеточном пространстве. Однако функциональная активность биоаминпродуцирующих клеток (гранулярных люминесцирующих, тучных клеток) остается на высоких значениях по отношению к интактным мышам, т.е. продукция и секреция нейроаминов сохраняется. До 40 минут физиологическая тенденция клеток продуцентов: гранулярных люминесцирующих и тучных клеток однонаправленная. Однако уже к 2-м часам от начала эксперимента имеются резкие различия как в расположении этих клеток, так и в содержании в них нейроаминов. Происходит дегрануляция тучных клеток и исчезновение нейроаминов в некоторых гранулах гранулярных люминесциру-ющих клетках. Число нейроаминпродуцирующих клеток снижается, происходит выход нейроаминов в межклеточное пространство из некоторых гранул, результатом чего является нарушение соотношения процессов регенерации гемопоэтических клеток.

Кроме того, в костном мозге выявлено регуляторное звено, состоящее из комплекса клеток – из гранулярной люминесцирующей, тучной клет-

Рис. 1. Срез костного мозга при аллопересадке костного мозга. А. Тучные клетки; Б. Мегакариоциты; В. Клетки эритроидного ряда. Реакция на маркер Bcl 2. Ув. 00 Микроскоп Leica DM 4000B.

ки, ретикулярной клетки и макрофага, которые содержат все изучаемые нейроамины и участвуют в размножении, дифференцировке, старении и умирании клеток. Начиная с ранних сроков после подсадки чужеродного костного мозга, нарушается структурная организация комплекса клеток продуцентов. Гранулярные люминесцирующие и тучные клетки располагаются неупорядоченно, теряют локализацию расположения около гемопоэтических островков. Таким образом, группы гемопоэтических клеток не получают достаточного количества нейроаминов, что приводит к нарушению процессов возобновления клеточных форм костного мозга. Через 2 часа данный комплекс распадается, и изменяется функционирование кроветворной ткани в костном мозге.

При анализе иммуногистохимии выявлено, что до 40 мин появляются единичные компактные тучные клетки. Можно предположить, что это образуются молодые клетки, позволяющие сохранять оптимальное содержание нейроаминов в костном мозге. Через 2 часа данные клетки разрушаются. Уменьшается число позитивных на белок Bcl 2 мегакариоцитов, что указывает о нарушенном тромбоцитопоэзе. Можно предположить, что аллопересадка костного мозга угнетает процессы апоптоза и пролиферации.

Следуя вышеизложенным данным, можно заключить, что аллогенная пересадка костного мозга приводит к численному снижению биоамин-продуцирующих клеток, с нарушенным синтезом нейроаминов и в последующем, к разрушению группы клеток-регуляторов, расположенных около островков размножения.

Выводы:

• 1.    При аллопересадке в костном мозге до 40 мин наблюдается увеличение числа нейроа-минпродуцирующих клеток, но в поздние сроки происходит уменьшение данных клеток и выход нейроаминов в межклеточное

• 2.    Происходит распад группы клеток, осуществляющих регуляцию содержания нейроаминов в костном мозге.

• 3.    Угнетаются процессы пролиферации и апоптоза в костном мозге после аллопересадки.

пространство с последующим распадом.