Нейротоксикологический профиль новых производных аденина, обладающих противовирусной активностью

В рамках дальнейшего изучения фармакологических свойств и определения широты диапазона безопасного действия новых веществ были исследованы токсикологические свойства 9-[2-(4-изопропилфенок-си)этил]аденин, под лабораторным шифром VMA-99-82, как типичного представителя этого класса химических соединений.

В настоящей работе представлены результаты изучения нейротоксикологического профиля соединения VMA-99-82 с использованием схемы многотестового наблюдения по «S.Irvin»

Методы. Эксперименты проводили на 90 белых лабораторных крысах обоего пола, массой 220240 г. Проведение всех экспериментов над животными руководствуется базисными, нормативными Рекомендациями Комитета по экспериментальной работе с использованием животных при Минздравсоцразвития России, Рекомендациями ВОЗ, «Международными рекомендациями по проведению медикобиологических исследований с использованием животных (1985)», а также согласно ГОСТ З 51000.396 и ГОСТ З 5100.4-96, правилами GLP. Приказом МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики РФ», а также с разрешения Регионального независимого этического комитета ГУ Волгоградский Научный Центр РАМН и АВО. Вещество VMA-99-82, на 50% водном растворе ДМСО вводили крысам внутрижелудочно (металлическим зондом) в арифметически возрастающих дозах от 18,7 до 4800 мг/кг за 1 час до тестирования.

Исследование нейротоксикологического профиля соединения VMA-99-82 проводилось по методу «S.Irvin» [4].

Спектр внешне наблюдаемых изменений, вызванных исследуемым веществом, выражали количественно по восьмибалльной шкале [5].

Кроме этого, в тесте «открытое поле» [6] у животных через 60 мин. после введения препарата исследовались двигательная, поисково-исследовательская и эмоциональная активности.

На втором этапе работ была проведена математическая обработка данных [5]. Интегральное состояние животных на каждую дозу отражалось графиком «дозовой траектории». По секторному местонахождению и местам преломления со сменой направления в пространстве траектории выделяли «особые точки» или так называемые, «особые дозы» вещества, способствующие резкому изменению профиля функционально – поведенческого статуса животных.

С учетом указанных точек на интегральном дозовом графике вещества VMA-99-82 рассчитывали уровни безопасного и токсического действия. Кроме того, с учетом данных ЛД50 у тестируемого вещества вычисляли диапазоны терапевтической активности, прогнозировали доклиническую степень безопасности.

Каждые сутки в течение двух недель отмечали количество погибших и выживших животных. Расчет LD50 производился по методу Личфилда-Вилкоксона (версия 1.03;18.10.93).

Результаты. По результатам экспериментов был выявлен профиль психоневрологического действия VMA-99-82 в диапазоне доз от 18,7 до 4800 мг/кг. В обобщенном виде данные отражены в таблице 1.

Установлено, что в дозе 18,7 мг/кг вещество VMA-99-82 не влияет на поведение и нервно-мышечную возбудимость крыс. У данных животных лишь несколько активируется частота дыханий и повышается ректальная температура (в среднем на 0,50С). После введения крысам VMA-99-82 в дозах 37,5 мг/кг в поведении животных существенных изменений не зафиксировано. Температура тела крыс повышалась также идентично группе, находящейся под влиянием VMA-99-82 в дозе 18,7 мг/кг. Более существенными

Таблица 1

Влияние вещества VMA-99-82 на функционально-поведенческий статус крыс

Параметры	Дозы вещества, мг/кг
	Н.Ш.*	18,7	37,5	75,0	150	300	600	1200	2400	4800

Поведенческие реакции

Вокализация	0	0	0	1	0	0	0	0	1	0
Настороженность	4	4	4	4	5	5	4	3	3	3
Пассивность	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
Стереотипия	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
Беспокойство	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
Агрессия	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
Груминг	4	4	4	4,5	4,5	4,5	4	4	3	2
Спонтанная двигательная активность	4	4	4	5	5	5	4,5	3	3	2

Нервно-мышечная возбудимость

Реакция на прикосновение	4	4	4,5	4,5	4,5	5	4,5	4,5	3	2
Реакция на боль	4	4	4,5	5	4,5	5	4,5	4,5	4	3
Реакция на стук	4	4	4	4,5	4	4	4	4	3	3
Тремор	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
Подергивание	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
Судороги	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
Расстройство походки	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
Тонус конечностей	4	4	4	4,2	4,5	4,5	4,5	4	3	3

Вегетативные эффекты

Положение мигательной перепонки	4	4	4	4	4	4	4	4	3	3
Размер зрачка	4	4	4	4	4	4	4	4	4	2
Саливация	4	4	4	4	4	4	4	4	4	5
Уринация	0	0	0	0	0	0	0	1	2	2
Дефекация	4	4	4	3	3	3	2	2	2	4
Температура	4	4,5	4,5	5	5,5	6	5	3	3	3
Цвет кожи	4	4,5	4,5	4,5	4,5	4,5	4	3	3	3
Частота дыхания	4	4,5	5	5,5	5,5	6	3,5	3,5	3	1

П р и м еч а н и е : НШ – оценка состояния животных в норме.

оказались эффекты испытуемого вещества, после введения в дозах от 75 до 300 мг/кг. В указанном интервале под действием VMA-99-82 у крыс дозозависимо повышались настороженность, груминг, спонтанная двигательная активность, также снижались пороги болевой и тактильной чувствительности, повышался тонус конечностей. Со стороны вегето-тропных эффектов, у крыс под действием вещества VMA-99-82 наблюдалось усиление дыхательной активности, прогрессирующее повышение ректальной температуры. У животных под действием вещества в дозе 300 мг/кг ректальная температура повышалась в среднем на 2-2,50С, а частота дыханий возросла в 2 раза. Кожные покровы крыс были гиперемирова-ны. В диапазоне доз от 600 до 4800 мг/кг у животных дозозависимо угнетались поведенческие реакции, нервно-мышечная возбудимость. В частности, снижались до нормы, а затем и ниже нормы акты груминга и горизонтальные формы передвижения. Повышались пороги болевой и тактильной чувствительности, понижалась ректальная температура (в среднем на 1,5-20С), угнеталось дыхание. У крыс под действием вещества в дозе 4800 мг/кг дыхание было единичным и не равномерным (до 5-10 актов в мин.).

Суммируя полученные данные, можно заключить, что фармакологическая активность вещества VMA-99-82, прослеживающаяся в диапазоне доз от 18,7 до 600 мг/кг, постепенно нивелируется при введении его в более высоких дозах. Эффекты VMA-99-82 после введения крысам в дозах от 1200 до 4800 мг/кг свидетельствуют о его токсическом влиянии.

Результаты балльной оценки эффектов вещества VMA-99-82 на спектры поведенческих, нервномышечных и вегетативных реакций и последующей интегральной обработке представлены в виде «дозовой траектории» круговой диаграммы на графике (рис. 2).

Рис. 1. Интегральная оценка острого влияния вещества VMA-99-82 на функционально-поведенческий статус крыс

Обоз н ач е н ия : римские цифры на «дозовой траектории» от I до IX соответствуют дозам вещества – 18,7 мг/кг; 37,5 мг/ кг; 75,0 мг/кг; 150,0 мг/кг; 300,0 мг/кг; 600,0 мг/кг; 1200,0 мг/кг; 2400,0 мг/кг; 4800,0 мг/кг.

Цифры на круговой диаграм м е : 1 – вокализация, 2 – настороженность, 3 – пассивность, 4 – стереотипия, 5 – беспокойство, 6 – агрессия, 7 – груминг, 8 – спонтанная двигательная активность, 9 – реакция на прикосновение, 10 – реакции на боль, 11 – реакции на стук, 12 – тремор, 13 – подергивание, 14 – судороги, 15 – расстройство походки, 16 – тонус конечностей, 17 – положение мигательной перепонки, 18 – размер зрачка, 19 – саливации, 20 – уринации, 21 – дефекации, 22 – температура, 23 – цвет кожи, 24 – частота дыханий.

Обсуждение. « Дозовая траектория» вещества VMA-99-82 на графике охватывает все три сектора функционально-поведенческого статуса крыс. Анализируя расположение дозовых точек на «дозовой траектории» диаграммы, можно предположить отсутствие существенного влияния вещества VMA-99-82 в дозе 18,7 мг/кг на спектры поведенческих и нервнорефлекторных реакций. При этом интегральное отражение эффектов вещества в точке I на « дозовой траектории» свидетельствует о превалировании влияний VMA-99-82 в дозе 18,7 мг/кг на центры терморегуляции и дыхание. В связи с этим можно предположить, что данная точка отражает минимальную фармакологическую активность вещества, которая не затрагивает качественную основу поведенческих и двигательных реакций. В следующем диапазоне точек от II до V (соответствуют дозам от 37,5 до 300 мг/ кг), расположенных на «дозовой траектории» испытуемого вещества, спектр его эффектов приблизительно одинаков, при этом точка II графика (доза вещества 37,5 мг/кг) расположена практически рядом с точкой I. Данное расположение точек на траектории свидетельствует о равном влиянии VMA-99-82 на поведенческо-функциональный статус крыс, причем в этой дозе у вещества превалируют эффекты вмешательства в центры теплорегуляции и дыхания, тогда как влияние на поведение остается минимальным, поэтому дозы VMA-99-82 от 18,7 до 37,5 мг/кг в плане влияния на ЦНС и поведение можно рассматривать как минимально эффективные (или, вероятно, разовые терапевтические, учитывая профиль противовирусной активности вещества). Все последующие дозы вещества до 300 мг/кг, отраженные на графике, обуславливают дозозависимый эффект влияния на ЦНС и поведенческий профиль. При этом в действии вещества начинают дозозависимо превалировать эффекты влияния на поведенческий статус крыс. То есть можно предположить, что в дозе 300 мг/кг (точка V) фармакологическая (или терапевтическая) активность будет максимальной. В данном диапазоне превалируют эффекты полезной фармакологической активности VMA-99-82, при этом побочные реакции выражены слабо. Последнее свидетельствует о том, что действие вещества VMA-99-82 в дозах от 18,7 до 300 мг/кг входит в диапазон безопасной терапевтической активности. Резкий сдвиг траектории дозовых эффектов в сторону сектора нервно-мышечной возбудимости, наблюдающийся в точках VI и VII, отражает произошедшие изменения в качественном реагировании гомеостатических структур организма крыс на вещество, введенное в дозах 600 и 1200 мг/ кг. Учитывая это, можно предположить, что фармакологическая эффективность вещества VMA-99-82 в диапазоне доз от III до V (соответственно от 75 до 300 мг/кг) сопряжена с побочными эффектами. Первоначально степень проявления этих эффектов предикторная. Однако при увеличении вводимых доз VMA-99-82 животным степень выраженности предикторов возрастает, а затем они начинают превалировать и снижать терапевтическую и безопасную ценность исследуемого вещества. Вместе с тем, все изменения, зафиксированные в этом диапазоне доз, у вещества восстанавливались в течение первых суток наблюдений и к гибели животных не приводили. В связи с этим можно заключить, что в диапазоне доз от 600 до 1200 мг/кг (точки VI и VII) фармакологическая активность вещества VMA-99-82 безопасна, но крайне низкая в отношении терапевтической эффективности.

Интегральное отражение эффектов вещества на «дозовой траектории» в точках VIII и IX (дозы от 2400 до 4800 мг/кг) наглядно иллюстрирует инверсию положительного действия VMA-99-82. В указанном диапазоне доз влияние вещества больше отражает динамику токсических эффектов. То есть можно заключить, что в дозах от 2400 до 4800 мг/кг вещество VMA-99-82 проявляет достоверно токсическую активность. По графику траектории интегральных «дозовых эффектов» видно, что общее состояние животных в обозначенных дозах резко инвертировано эффектам, наблюдающимся в диапазонах доз от 18,7 до 300 мг/кг. В данном случае преобладают эффекты влияния VMA-99-82 на вегетотропные реакции, которые оказались необратимыми (т.е. токсическими) и способствовали гибели животных.

В результате проведенных исследований установлено, что в диапазоне от 18,7 до 4800 мг/кг в действии вещества VMA-99-82 на психоневрологический статус крыс прослеживаются четыре этапа. При этом в первой и второй зонах отчетливо прослеживаются нарастающие дозозависимые эффекты. На «дозовой траектории» точки I-V (дозы вещества от 18,7 до 300 мг/кг) расположены по вертикали рядом, поэтому влияние исследуемого соединения на психоневрологический статус крыс можно рассматривать как эффективное. Третью зону активности вещества VMA-99-82 в диапазоне доз, расположенных на траектории в точках V-VII (соответствует 300-1200 мг/кг), можно отнести к диапазону безопасной активности вещества VMA-99-82 с минимальной терапевтической активностью и выраженными побочными эффектами. Четвертая зона соответствует токсическому диапазону активности вещества в дозах 2400 и 4800 мг/кг.

Заключение. По уровню токсичности и по степени безопасности вещество VMA-99-82 относится к классу малотоксичных соединений. ЛД₅₀ составил 4000 мг/кг.

Активность вещества VMA-99-82 в диапазоне доз от 18,7 до 300 мг/кг свидетельствует об отчетливой терапевтической активности вещества, в которой сопутствующие побочные эффекты выражены несущественно.

Терапевтическая активность соединения VMA-99-82 находится в основном в области поведенческих реакций, что представляет интерес для дальнейшего углубленного изучения психотропной активности и механизма действия вещества.