NK-клетки, предобработанные эстриолом и клетками комменсальной флоры, регулируют созревание TREG и TH17 из CD4+ лимфоцитов у больных рассеянным склерозом и здоровых доноров

Рассеянный склероз (РС) – это воспалительное хроническое заболевание центральной нервной системы, одним из патогенетических механизмов которого является иммуноопосредованная атака миелиновой оболочки нервных аксонов под управлением аутореактивных Т-клеток [Jadidi-Niaragh, Mirshafiey, 2011]. NK-клетки, один из подтипов ILC клеток, обладают способностью регулировать аутоиммунные механизмы посредством продукции цитокинов или цитотоксического действия непосредственно против эффекторных клеток, таких как аутореактивные Т-клетки или антигенпрезентирующие клетки. В то же время они также могут лизировать лиганды NKG2D микроглии, астроцитов и олигодендроцитов, что указывает на двойную функцию NK-клеток при РС. Кроме того, установлено, что NK-опосредованный контроль активности T-клеток нарушен при РС, но может быть восстановлен путем лечения даклизума-бом [Gross et al., 2016]. Также в одной из недавних работ показано, что ILC клетки презентируют Т-лимфоцитам пептидные фрагменты антигенов бактериального происхождения в комплексе с молекулами MHC II класса. Однако по причине того, что на мембране ILC клеток нет костимулирующих молекул, эта презентация носит толерогенный, а не активирующий характер. То есть ILC клетки учат Т-лимфоциты «не трогать» симбиотическую флору [Hepworth et al., 2015]. При этом метаболиты бактерий, а также их пробиотические штаммы способны оказывать влияние на функциональные характеристики ILC [von Burg et al., 2015; Aziz, Bonavida, 2016].

Известно, что частота РС у женщин гораздо выше, чем у мужчин [Harbo, Gold, Tintore, 2013]. Установлено, что при беременности наблюдается ослабление проявлений Th1-опосредованных аутоиммунных патологий, в том числе РС [Pelfrey et al., 2005; Neuteboom et al., 2012]. Учитывая, что гестационный процесс сопровождается существенной гормональной перестройкой, можно предположить, что гормоны плаценты являются теми факторами, которые ослабляют течение РС. Одним из возможных кандидатов на роль регулятора функций иммунных клеток при РС является эстриол (Е 3 ) [Sicotte, 2002; Voskuhl et al., 2016]. Его уровень возрастает с 7-й недели беременности вплоть до родов практически в 10 раз, в то время как у небеременных женщин Е 3 продуцируется в очень малых количествах и практически не определяется. Показано, что данный гормон способен эффективно регулировать функции лейкоцитов как здоровых доноров, так и больных РС [Soldan et al., 2003; Ширшев, Некрасова, 2011 ; Papenfuss et al., 2011; Некрасова, Ширшев, 2013; Ширшев и др., 2017, 2018; Nekrasova, Shirshev, 2020].

Цель данной работы – исследовать влияние обработанных Е 3 , а также стимулированных клетками комменсальной микрофлоры NK-клеток на регуляцию баланса Treg/Th17 лимфоцитов.

Материалы и методы

В качестве объекта исследования использовали кровь больных РС, согласно модифицированным диагностическим критериям МакДональда [McDonald et al., 2001], с ремитирующим типом течения заболевания, не подвергавшихся терапии препаратами, изменяющими течение РС, а также иммуномодулирующей терапии и находящихся в стадии клинической ремиссии (n=10), и здоровых небеременных женщин репродуктивного возраста (n=10).

В градиенте плотности фиколл-верографина (1.077 г/мл) выделяли мононуклеары периферической крови (МПК), из которых затем методом иммуномагнитной сепарации выделяли NK-клетки и CD4+ лимфоциты. Полученные NK-клетки инкубировали с Е3 в концентрациях, соответствующих уровням данного гормона во время I и III триместров физиологически протекающей беременности – 2 и 20 нг/мл [Kase, Reyniak, 1985], в течение 48 ч. при 37оС в условиях 5% СО2 в среде RPMI 1640 с добавлением 1 мМ HEPES и 2 мМ L-глутамина. В контрольные пробы вместо гормона вносили соответствующий растворитель.

В ряде проб для активации NK-клеток использовались штаммы Ecsherichia coli K12 и Lactobacillus plantarum 8R-A3. Бактерии (1 x 10 6 ) выращивали в течение 18 ч. на LB и MRS бульоне соответственно при 37ºС. Ночные культуры центрифугировали при 13 000 об/мин, бактерии ресуспендировали в 0.9% NaCl. Срок контакта с NK-клетками составлял 30 мин., после чего добавляли гентамицин (конечная концентрация 100 мкг/мл).

После обработки гормоном и/или бактериями NK-клетки культивировали в течение 48 ч. совместно с сингенными сепарированными лимфоцитами CD4+, у которых затем методом проточной цитометрии определяли экспрессию маркеров FOXP3 и RORγt (все антитела «Biolegend», США).

Статистический анализ проводили с использованием W критерия Вилкоксона. Результаты представлены в виде медианы, верхнего и нижнего квартилей Me (LQ; UQ).

Результаты и обсуждение

При исследовании влияния NK-клеток здоровых доноров на образование Treg установлено, что предобработка E. coli , в том числе в комбинации с Е 3 вне зависимости от концентрации, способствовала генерации Treg при взаимодействии с NK-клетками. При этом предобработка Е 3 и L. plantarum не приводила к статистически значимому изменению уровня данной субпопуляции регуляторных лимфоцитов (таблица).

Влияние NK-клеток, обработанных Е 3 и бактериальными штаммами, на изменение процентного соотношения Treg и Th17 клеток у здоровых доноров и больных РС [Effect of NK cells treated with E 3 and bacterial strains on Treg and Th17 percentage in healthy donors and MS patients]

Примечание. * – p < 0.05 по сравнению с контролем.

В отношении способности NK-клеток больных РС влиять на изменение процентного соотношения Treg выявлено стимулирующее действие Е 3 вне зависимости от используемой концентрации. Ранее нами показано, что Е 3 способен стимулировать продукцию TGF-β сепарированными NK-клетками [Ширшев и др., 2016]. Известно, что данный цитокин способствует дифференцировке в направлении Treg [Xu, Kitani, Strober, 2010]. Как и в случае здоровых доноров, бактерии E.coli также способствовали увеличению количества Treg при взаимодействии с NK-клетками больных РС. В комбинации с Е 3 вне зависимости от концентрации данное влияние бактериального штамма сохранялось (таблица).

При исследовании влияния NK-клеток здоровых доноров на образование Th17 значимых изменений не обнаружено. Статистически достоверный эффект получен только на клетках больных РС. Так, предобработка NK-клеток штаммом L. plantarum , в том числе в комбинации с Е 3 , способствует угнетению формирования Th17. Аналогичным действием обладает штамм E.coli , но лишь при совместном действии с Е 3 (2 нг/мл). Сам гормон значимого влияния на изменение процента Th17 лимфоцитов не оказал (таблица).

Известно, что децидуальные NK-клетки способны как индуцировать Treg (при участии CD14⁺ клеток) [Vacca et al., 2010], так и угнетать образование Th17 [Fu et al., 2013]. По-видимому, гормон беременности Е 3 , как и клетки комменсальной микрофлоры, являются факторами, приводящими к формированию толерогенного фенотипа NK-клеток, которые в свою очередь смещают баланс Th17/Treg в сторону последних.

Заключение

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что NK-клетки, предобработанные гормоном беременности Е 3 и штаммами комменсальной микробиоты, способны к регуляции баланса Treg/Th17. При этом выявлены различия в действии исследуемых факторов. Так, NK-клетки, проинкубированные с Е 3 и E. coli стимулируют образование Treg, а предобработка NK-клеток L. plantarum угнетает формирование Th17 из CD4⁺ лимфоцитов. В целом, регуляторные лимфоциты больных РС оказались более чувствительны к влиянию NK-клеток, чем клетки здоровых доноров.