Ноцицептивные реакции у крыс с различной поведенческой активностью при введении липополисахарида в поясной пучок

В последнее десятилетие накоплен значительный фактический материал, убедительно свидетельствующий о существенной роли иммунных механизмов в развитии болевых синдромов. Активное участие иммунной системы в модуляции нейрональных процессов мозга, ноцицептивных в частности, делает ее молекулярные механизмы привлекательными мишенями для создания новых фармакологических препаратов, способных предотвратить или ослабить проявления болевых реакций различного генеза. В связи с этим, изучению взаимодействия нервных, гуморальных и иммунных процессов в механизмах регуляции болевой чувствительности в настоящее время предается особенно пристальное внимание [1, 9, 14]. Иммунная система является необходимым участником ноцицептивных реакций при различных заболеваниях в остром периоде и играет особенно важную роль в формировании хронических болевых синдромов [6, 16, 19]. Симптоматическое лечение хронических болей, основанное на применении аналгетиков, физиотерапевтические процедуры или различные варианты акупунктуры не во всех случаях эффективны. Все это указывает на актуальность изучения иммунных процессов в механизмах формирования болевых реакций.

Также, можно считать установленным тесное взаимодействие иммунных и стрессорных факторов в механизмах регуляции ноцицептивных реакций [10]. Но при этом, остается до конца невыясненным вопрос о характере модуляции болевой чувствительности в случаях общей стимуляции иммунных процессов и направленности изменений ноцицептивных реакций, связанной с уровнем активности неспецифической стрессорной системы. Изучение влияния стимуляторов иммунитета на болевые реакции в зависимости от исходного состояния стрессорной системы позволяет подойти к пониманию причин возникновения хронических болевых синдромов у пациентов различной типологии.

В наших предыдущих работах [2, 4] установлено, что показатели болевой реакции отличаются у животных с различной прогностической устойчивостью к стрессу. Из общего количества исследуемых крыс выделены 3 группы животных, различающихся по показателям стресс-реактивности и ноцицепции. Максимальные значения латентного периода реакции отведения хвоста отмечались у резистентных и стресс-предрасположенных животных, а минимальные - у животных из группы с промежуточными значениями стресс-реактивности.

Нами также было обнаружено, что разрушение каудального участка поясного пучка оказывает подавляющий эффект на эмоциональный компонент ноцицептивной реакции [3, 12], имеющий иммунную составляющую. При этом остаются невыясненными вопросы генеза болей, самостоятельной причиной которых могут быть начальные изменения иммунных процессов с участием структур головного мозга. Перцепция и эмоциональная оценка боли относится к функциональной активности корковых и лимбических структур мозга. Неоднократно показано участие поясной коры и поясного пучка мозга в перцептуальном и эмоциональном компонентах ноцицепции [12, 15, 18]. В тоже время, центральные механизмы иммунозависимой регуляции боли изучены недостаточно. В связи с этим, изучение центральных иммунозависи-мых механизмов ноцицепции с участием лимбических структур является актуальным и перспективным направлением исследований.

Для исследования вопроса о характере ноцицепции в условиях стимуляции иммунных процессов мы применили липополисахарид («Пирогенал»). Липополисахариды (ЛПС) относятся к типичным антигенам и стимуляторам иммунных реакций, что обусловлено их включением в состав мембран микробных клеток. Воздействие ЛПС приводит к острой фазе иммунного ответа, опосредованной секрецией интерлейкинов иммунными клетками крови. Одним из результатов воздействия ЛПС является поликлональная активация В-лимфоцитов с последующим увеличением количества плазмоцитов, вырабатывающих антитела. ЛПС относят к числу факторов, влияющих на фагоцитарную функцию макрофагов - антигенпрезентирующих клеток, играющих важную роль в индукции иммунного ответа и реализации его эффекторной функции. Описана ЛПС-зависимая активация Т-лимфоцитов. Показано, что ЛПС может как стимулировать, так и подавлять иммунный ответ [7]. Таким образом, липополисахариды могут влиять на основные эффекторные клетки иммунной системы и способствовать возникновению иммунных нарушений. Обнаружение или рецепция ЛПС является сигналом инфекционных воздействий на организм, что составляет первое и необходимое звено в организации защитных реакций. Введение ЛПС, в свою очередь, является естественной моделью активации иммунных процессов, в том числе в структурах головного мозга, где ключевую роль в активации врожденного иммунитета играют Толл-подобные рецепторы, локализующиеся на различных иммунокомпетентных клетках (астроцитах и глии в ЦНС), и маннозные рецепторы, экспрессируемые на поверхности периваскулярных макрофагов, астроцитов и микроглии, распознающие олиго- и полисахариды грамположительных и грамотрицательных бактерий. После связывания с патогеном Толл-подобные и маннозные рецепторы передают внутриклеточный сигнал на активацию синтеза цитокинов, активируют специфические сочетания цитокинов и ко-стимулирующих факторов, что в конечном итоге определяет тип и эффективность развивающегося приобретенного иммунного ответа [13].

Российский препарат «Пирогенал», согласно офици-нальным справочным данным, является липополисахаридом микробных клеток Pseudomonаs aeruginosa [11]. Применение Пирогенала у здоровых животных позволяет моделировать иммунный ответ и изучать его влияние на болевую чувствительность. Препарат вводили в каудальную часть поясного пучка, являющегося местом формирования анатомических связей между различными структурами головного мозга млекопитающих. Мы предположили, что инициация иммунных процессов в структурах головного мозга (поясного пучка, в частности), имеющих отношение к проведению и модуляции болевой информации, у животных с различной стресс - реактивностью может по-разному отразиться на уровне их болевой чувствительности.

Таким образом, целью представленной работы явилось изучение различных поведенческих проявлений болевой реакции у крыс в условиях стимуляции иммунитета липоплисахаридом с учетом состояния стрессорной системы животных.

Методика исследования.

Эксперименты проведены на 43 крысах - самцах линии "Вистар": возраст - 8-12 месяцев, масса - 220-280 гр. При проведении экспериментов руководствовались «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденными на заседании этической комиссии ГУ НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАМН (протокол №1 от 3.09.2005), требованиями Всемирного общества защиты животных (WSPA) и Европейской конвенции по защите экспериментальных животных.

Всех животных предварительно тестировали в «открытом поле» [8] с определением двигательной активности в течение 5 мин. Регистрировали латентный период (ЛП) первого перемещения, ЛП выхода в центр, количество пересеченных периферических и центральных квадратов, количество периферических и центральных стоек, исследовательскую активность, время груминга и показатель вегетативного баланса (количество болюсов). До- полнительно вычисляли коэффициент устойчивости к стрессу (КУС), равный отношению суммы горизонтальной двигательной активности к сумме ЛП первого движения и ЛП выхода в центр. Определяли также исходные пороги ноцицептивных реакций; прежде всего латентный период отведения хвоста (ЛП РОХ) на его термальное раздражение по стандартной методике "тейл-флик" с использованием специализированного прибора Tail-Flick Analgesia Meter 0104-301M (Columbus Instruments, США). Животных размещали в специальных домиках-цилиндрах, в которых они находились в течение 30 минут с выведенным наружу хвостом для адаптации к условиям эксперимента. После этого определяли ЛП РОХ (сек.) 5 раз с интервалом 3-5 минут. Итоговым показателем служила средняя арифметическая латентных периодов. Эмоциональный компонент ноцицепции определяли по порогу вокализации крыс (ПВ, мА) в ответ на электрокожное раздражение хвоста. Для этого применяли металлические кольцевые электроды, располагаемые на хвосте животных, и электростимулятор SEN-3201 (Nihon Kohden, Япония). Параметры электростимуляции: частота – 10 Гц, длительность импульса – 0,5 мс; силу тока постепенно увеличивали до появления реакции писка (вокализации) у крыс (от 0,3 до 0,95 мА).

После регистрации исходных ноцицептивных порогов крыс наркотизировали нембуталом (30 мг/кг), размещали в стереотаксическом приборе для мелких лабораторных животных (TSE-systems, Германия) и скальпировали. Через трепанационные отверстия Пирогенал или физиологический раствор вводили по координатам атласа [17] в каудальную часть поясного пучка (AP= - 4,5 мм , L= + 1 мм, H=1,5 мм) в объеме 5 мкл с помощью шприца Гамильтона, закрепленного в специальном инъецирующем устройстве. Доза ЛПС составила 0,05 мкг. На 1, 3 и 7 сутки после микроинъекции препаратов повторно регистрировали значения ноцицептивных порогов.

Cтатистическую обработку данных проводили с помощью стандартных статистических методов, входящих в пакеты прикладных программ Excel c использованием параметрического t-критерия Стьюдента.

Результаты исследования. Предварительное стандартное тестирование крыс в «открытом поле» для определения индивидуально-типологических особенностей позволило отобрать для экспериментов животных с крайними показателями КУС (амбивалентные животные со значениями КУС близкими к единице из дальнейших исследований удалены) и разделить их на 2 группы – устойчивых и неустойчивых к стрессу по следующим критериям. К первым отнесли крыс с коротким ЛП первого перемещения (< 3 c), c высокой двигательной активностью (число пересеченных квадратов > 80, вертикальных стоек >8, исследованных объектов >5, длительность груминга >11 c) и незначительным количеством болюсов (<2). Указанные критерии соотносились с КУС следующим образом: чем больше значение этого коэффициента по отношению к единице, тем выше устойчивость животных к стрессу; чем меньше КУС по сравнению с единицей, тем ниже устойчивость. В результате в 1 группу вошли 21 активных, резистентных к стрессу крыс (КУС от 2,0 до 5,5). Вторую группу составили 22 пассивных, не резистентных к стрессу животных при значении КУС от 0,2 до 0,85. И та, и другая группа в дальнейшем были разделены на две подгруппы, животным из которых вводили либо физиологический раствор (контроль), либо Пирогенал (экспериментальные группы).

При анализе фоновых показателей ноцицепции у активных крыс (n=11) обнаружены достоверно (P<0,05) более высокие значения ЛПРОХ и ПВ (Рис.1) по сравнению с пассивными животными (n=11).

Введение физиологического раствора в каудальную зону поясного пучка не вызывало каких-либо достоверных изменений показателей ноцицепции как у активных (n=10), так и у пассивных крыс (n=11).

Искусственная стимуляция иммунных процессов в поясном пучке, вызываемая микроинъекцией ЛПС, приводила к различным эффектам на ноцицептивные показатели у животных экспериментальных групп. При регистрации перцептуального компонента ноцицептивной реакции в указанных временных рамках эксперимента у активных животных (n=11) обнаружено динамическое (не достоверное) увеличение ЛП РОХ (рис. 2А), тогда как у пассивных крыс (n=11) отмечена обратная тенденция изменения этого показателя (рис. 2Б). При анализе эмоционального восприятия боли на фоне антигенной стимуляции ЛПС отмечено его усиление на 7 сутки после введения антигена как у активных (n=11), так и у пассивных (n=11) крыс. При этом гипералгетический эффект микроинъекции ЛПС на ПВ в большей степени был выражен у пассивных животных (рис. 3).

В целом, стимуляция иммунных процессов Пироге-налом в каудальной зоне поясного пучка сопровождается, главным образом, снижением порогов ноцицептивных реакций у пассивных, неустойчивых к стрессу крыс. Особенно заметно и достоверно снижались пороги вокализации на 7 сутки исследования, что позволяет говорить об облегчении эмоционального выражения чувства боли в условиях стимуляции иммунитета в исследуемой структуре. Такая ноцицептивная сенситизация эмоциональной сферы создает условия для возникновения боли при действии любых пусковых факторов, прежде всего, у пассивных особей. Устойчивые к стрессу животные более защищены от гипералгетического действия ЛПС и, возможно, других антигенов.

Результаты настоящего исследования согласуются с данными экспериментов [5], в которых сопоставлялась динамика изменения ректальной температуры в ответ на системное введение Пирогенала с ноцицептивными порогами и учетом индивидуально-типологических особенностей животных. Выраженность гипертермии, вызванной инъекцией ЛПС, оказалась различной у активных и пассивных животных. У крыс с высокими значениями индекса активности Пирогенал вызывал достоверно значимое повышение температуры (на 2 градуса) по сравнению с повышением температуры (на 1 градус) у животных с низкими значениями индекса активности.

Взаимосвязь между стресс-реакциями и иммунитетом не вызывает сомнений. В зависимости от интенсивности и длительности различные виды стрессорных воздействий, включая ноцицептивные, способны активировать или угнетать иммунитет. С другой стороны, первичные изменения иммунных процессов оказывают влияние на ноцицептивные реакции и, возможно, на устойчивость к стрессу.

В нашей работе, таким образом, обнаружена положительная корреляция ноцицептивной устойчивости с более выраженной иммунной реактивностью у резистентных животных по сравнению с пассивными животными на фоне антигенной стимуляции поясного пучка липополисахаридом.