Нокаут гистоновой метилтрансферазы NSD1 приводит к снижению пролиферации и увеличению чувствительности к цисплатину клеток плоскоклеточного рака гортани

Инициирование и развитие опухолей являются следствием мутаций в клетках. Накопленные знания об эпигенетических механизмах являются доказательством того, что изменения эпигенетического профиля также играют критическую роль в канцерогенезе: реорганизация хроматина обеспечивает доступ факторов транскрипции к ДНК, что способствует повышению экспрессии генов, ответственных за пролиферацию раковых клеток. Под эпигенетическими механизмами регуляции принято понимать такие ключевые процессы, как метилирование ДНК, различные модификации гистоновых белков и изменения в профилях некодирующих РНК [1]. Гистоновые белки, составляющие строительные блоки хроматина, модифицированы различными посттрансляционными модификациями (ПТМ), которые регулируют структуру и функцию хроматина [2]. Модификации гистонов регулируют экспрессию генов двумя основными способами. К первому относятся модификации, непосредственно влияющие на общую структуру хроматина, такие как ацетилирование, нейтрализующее положительный заряд гистонов, ослабляющее электростатические взаимодействия с ДНК и приводящее к релаксации хроматина, который становится более доступным для транскрипционных факторов [3]. В отличие от ацетилирования добавление метильных групп существенно не изменяет заряд гистонов и не влияет непосредственно на структуру хроматина; однако метилирование создает сайты связывания для различных нижестоящих эффекторных белков, которые также обеспечивают привлечение факторов транскрипции [3]. Одной из важнейших гистоновых модификаций является диметилирование лизина 36 на гистоне 3 (H3K36me2), которое участвует в регуляции экспрессии генов [4] и поддерживает стабильность хроматина, участвуя в репарации ДНK [5, 6]. Аберрантное метилирование гистонов, в том числе H3K36me2, часто обнаруживается при развитии и прогрессировании различных опухолей [7]. Метилирование гистонов катализируется ферментами гистонметилтрансферазами (ГМТ) [8]. Диметилирование гистона H3K36 по всему геному опосредуется ферментами NSD1, NSD2, NSD3 и ASH1L [9]. Было показано, что ген ГМТ NSD1 часто мутирован при плоскоклеточном раке головы и шеи, и от 10 до 13 % пациентов с данным диагнозом имеют мутацию в гене NSD1 [10, 11].

Плоскоклеточная карцинома головы и шеи включает в себя разнообразную группу опухо- лей, которые классифицируются по различным анатомическим локализациям (полость рта, ротоглотка, гортаноглотка, гортань и носоглотка), что, в свою очередь, характеризует их различной эпидемиологией, клиническим прогнозом [12]. Также интересно заметить, что именно рак гортани характеризуется наивысшей корреляцией между наличием мутаций NSD1 и повышенной выживаемостью пациентов [13]. При этом ранее роль NSD1 в раке гортани in vitro исследована не была. Также известно, что немелкоклеточный рак легкого имеет с раком гортани схожую этиологию, развиваясь из энтодермальных клеток, что позволяет предположить наличие схожих молекулярных механизмов в клетках плоскоклеточного рака головы и шеи и немелкоклеточного рака легкого. Ранее сообщалось об идентификации подтипа плоскоклеточного рака легкого, обогащенного инактивирующими мутациями NSD1, который эпигенетически и транс-крипционно аналогичен подтипу рака головы шеи с мутациями NSD1 [14].

Целью исследования стали изучение роли ГМТ NSD1 в росте клеток карциномы гортани и немелкоклеточного рака легкого и оценка влияния нарушения экспрессии NSD1 на чувствительность клеток к цисплатину.

Материал и методы

Анализ базы данных TCGA

Для корреляционного анализа показателей выживаемости пациентов с плоскоклеточным раком головы и шеи и мутаций в гене NSD1 использовались данные базы Атлас ракового генома (TCGA) на портале Использовался набор данных TCGA_PanCancer, представленный на 20.10.2022.

Клеточные линии

В качестве объекта исследования были использованы клеточные линии плоскоклеточного рака гортани JHU011, JHU022 (клеточные линии были подарены Е.И. Изюмченко, Чикагский Университет, США) и аденокарциномы легкого А549 (American Tissue Culture Collection, ATCC). Клеточные линии культивировались в стандартной среде RPMI-164 c содержанием 10 % эмбриональной телячьей сыворотки, 1 % пенициллина и стрептомицина и 1 % L-глутамина.

Нокаут гена NSD1 с применением технологии CRISPR/Cas9

Для получения клеточных линий со стабильным нокаутом гена NSD1 использовали вектор Lenti-CRISPR v2.0 (Addgene, США), кодирующий эндонуклеазу Cas9 и гидовую РНК (гРНК). Для нокаута NSD1 использовали следующую последовательность гРНК: 5’- GTTTGCACTTCCTTGAGTCC -3’. Клеточные линии, стабильно экспрессирующие Cas9 и гРНК, получали с использованием метода лентивирусной трансдукции. Вирусные частицы нарабатывали в клетках HEK293T, используя трехкомпонентную лентивирусную систему, которая включает в себя упаковочный вектор psPAX2 (packing), кодирующий лентивирусную оболочку, и оболочечный вектор pCMV-VSV-G (envelope), кодирующий компоненты вирусного капсида, и вектор LentiCRISPRv2.0 c гидовой РНК (в качестве контроля использовали вектор LentiCRISPRv2.0, не несущий гидовую РНК). Далее среду, содержащую вирусные частицы, фильтровали и переносили на монослой клеток JHU011, JHU022 и A549, добавляя полибрен (6 мкг/мл) для улучшения проницаемости клеточной мембраны; заражение клеток вирусными частицами проводили в течение 48 ч. Далее заменяли среду и добавляли селектирующий агент (пуромицин концентрацией 1 мкг/мл); растили клетки параллельно с контрольными, нетрансдуцированными, до гибели последних. Далее проводили селекцию отдельных нокаутных клонов. После разрастания клонов проводили проверку нокаута при помощи иммуноблоттинга. Для последующей работы был выбран один клон для каждой клеточной линии.

Иммуноблоттинг

Иммуноблоттинг проводили согласно стандартному протоколу, который был подробно описан нами ранее [15]. Использовали следующие первичные антитела: NSD1 (#75-280, NeuroMab, США), Di-Methyl-Histone H3 (Lys36) (# 2901, Cell Signaling, США), Histone H3 (#14269, Cell Signaling, США), Vinculin (#13901, Cell Signaling, США). Сигнал детектировали с помощью светочувствительной фотографической пленки с использованием хемилюминесцентного субстрата SuperSignal West Pico Plus (ThermoScientific, США). Пленки сканировались, далее количественный анализ полученных изображений осуществляли в программе ImageJ, измеряя оптическую плотность почернения светочувствительного слоя фотографических пленок.

Тест по оценке пролиферативной активности клеток

В 96-луночный планшет рассаживали 500 клеток на лунку. Для определения скорости пролиферации клеток с нокаутом NSD1 и без него были выбраны следующие временные точки: 24, 72, 96, 120, 144 и 168 ч. Измерения пролиферативной активности проводили с помощью набора CellTiter-Blue Cell Viability Assay (Promega, США), который работает на основе способности живых клеток конвертировать раствор нефлуоресцирующего резазурина в флуоресцирующий резорфу-рин. После добавления реагента для измерения пролиферации планшет инкубировали в течение двух часов в CO ₂ -инкубаторе при 37 °C. Измеряли флуоресценцию при длине волны 560/590 нм с помощью планшетного ридера (Biotek, США).

Скорость пролиферации клеток рассчитывали как относительную величину, принимая за единицу значение флуоресценции во временной точке 24 ч. Кривые роста клеток строили с использованием программы GraphPad Prism.

Определение жизнеспособности клеток под действием цисплатина

В 96-луночный планшет рассаживали 1000 клеток на лунку. Далее к клеткам добавляли цисплатин в различной концентрации и оставляли инкубироваться в CO ₂ -инкубаторе при 37 °C в течение 72 ч. По окончании инкубации добавляли реагент для оценки пролиферативной активности CellTiter-Blue Cell Viability Assay (Promega, США) и проводили измерения, как было описано выше (см. «Тест на пролиферативную активность клеток»). Кривые для определения полуингибирующей концентрации цисплатина (IC50) строили с использованием программы GraphPad Prism.

Статистическая обработка данных

Для анализа данных, полученных из базы TCGA_PanCancer, использовались инструменты, представленные на портале http://www.cbioportal. org. Для сравнения кривых выживаемости Каплана‒Майера использовался логарифмический ранговый тест (Longrank-тест). Статистическая обработка экспериментально полученных данных проводилась с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 9.1.1 (Сан-Диего, США). Для определения статистической значимости при сравнении двух независимых выборок использовали непараметрический критерий Манна–Уитни. При анализе данных пролиферативной активности клеток использовался двухфакторный дисперсионный анализ (Two-way ANOVA), так как оценивался уровень флуоресценции в зависимости от двух факторов – время (часы) и статус гена NSD1 (контроль и нокаут). При p˂0,05 результаты считали статистически значимыми.

Результаты и их обсуждение

Влияние мутаций NSD1

на продолжительность жизни пациентов с плоскоклеточным раком головы и шеи

Из анализа базы данных TCGA_PanCancer, которая включала в себя 523 образца (из них 496 образцов, которые имели информацию об NSD1 мутациях), можно заключить, что наличие мутаций NSD1 коррелирует с общей выживаемостью у пациентов с плоскоклеточным раком головы и шеи. Общая продолжительность жизни пациентов, имеющих опухоли с мутациями в гене NSD1, выше, чем у пациентов без мутаций NSD1: медианы выживаемости составляют 95,34 и 52,31 мес соответственно (p=0,0423 ) (рис. 1A). Помимо этого, когорта пациентов с мутациями NSD1 также

Когорта с мутациями NSD1 Cohort with NSD1 mutations

Когорта без мутаций NSD1

Cohort without NSD1 mutations

месяцы                                      месяцы months                                         months

Общая выживаемость

Overall Survival

Беспрогрессивная выживаемость Progression Free Survival

	Количество образцов Number of Patients	Медиана выживания (месяцев, ДИ 95%) Median of Survival (months, 95% Cl)		Количество образцов Number of Patients	Медиана выживания (месяцев, ДИ 95%) Median of Survival (months, 95% Cl)
Когорта с мутациями NSD1 Cohort with NSD1 mutations	64	95.34 (48.2 - NA)	Когорта с мутациями NSD1 Cohort with NSD1 mutations	64	107.9 (48.2 - NA)
Когорта без мутаций NSD1 Cohort without NSD1 mutations	432	52.31 (35.51 - 65.82)	Когорта без мутаций NSD1 Cohort without NSD1 mutations	432	53.64 (45.01 -84.49)

Рис. 1. Корреляция наличия мутаций в гене NSD1 c ОВ и БВП пациентов c плоскоклеточным раком головы и шеи. Кривые общей (ОВ) и беспрогрессивной (БПВ) выживаемости, построенные методом Каплана–Мейера на основе данных, полученных из TCGA_PanCancer на портале (А – ОВ, Б – БВП)

Fig. 1. The correlation of NSD1 mutations with OS and PFS in head and neck squamous cell carcinoma patients. Overall survival (OS) and progression-free survival (PFS) curves plotted using the Kaplan–Meier method, using TCGA_PanCancer at (A – OS, B – PFS)

имеет тренд к более продолжительному периоду беспрогрессивной выживаемости по сравнению с когортой, не имеющей мутаций NSD1: медианы составляют 107,9 и 53,64 мес соответственно (p=0,0545). Полученные в результате анализа базы TCGA_PanCancer данные согласуются с ранее опубликованными исследованиями, согласно которым примерно у 10–13 % пациентов с раком головы, шеи мутирован ген фермента NSD1; вместе с этим наблюдается значительное повышение выживаемости таких пациентов [10, 11]. Также для пациентов с диагнозом рак гортани повреждающие мутации в NSD1 и NSD2 служат маркером благоприятного прогноза [13]. Интересно, что корреляция между наличием мутаций NSD1 и улучшенной выживаемостью пациентов наблюдалась в когорте с отрицательным результатом анализа на вирус папилломы человека (ВПЧ), тогда как наличие ВПЧ и мутаций NSD1, а также низкая экспрессия белка NSD1 коррелировали с ухудшением про- гноза для пациентов [11, 16]. Но стоит отметить, что когорты ВПЧ-положительных пациентов в данных исследованиях были ограниченными, и утверждение о влиянии NSD1-мутаций при ВПЧ-положительном плоскоклеточном раке головы и шеи еще требует дополнительных исследований. Таким образом, мутации NSD1 могут служить маркером благоприятного прогноза для пациентов с плоскоклеточным раком головы и шеи и отрицательным ВПЧ-статусом.

Получение клеточных линийс нокаутом гена NSD1

Для того чтобы исследовать роль NSD1 в росте опухолевых клеток in vitro, необходимо было получить клеточные модели, в которых экспрессия NSD1 была бы подавлена. Для решения этой задачи мы выбрали метод создания нокаутных клеточных линий с помощью системы CRISPR/Cas9, которая является эффективным инструментом выключения

А/А

JHU Oil

JHU 022

A549

B/C

a:

и a 21

Риc. 2. Подавление экспрессии белка NSD1 с использованием технологии CRISPR/Cas9 в клеточных линих плоскоклеточного рака гортани и аденокарциномы легкого. Оценка эффективности нокаута NSD1 методом иммуноблоттинга: A – экспрессия NSD1 в клеточных линиях JHU 011, JHU 022 и А549; Б – экспрессия H3K36me2 в клеточных линиях JHU 011, JHU 022 и А549;

В – квантификация изменения уровня белка H3K36me² в результате нокаута NSD1 в клеточных линиях JHU 011, JHU 022 и А549; Vinculin и H3 histone использовали в качестве контроля загрузки. Вариабельность данных представлена как стандартная ошибка среднего (m ± SEM; n=3), непараметрический критерий Манна–Уитни: * – p<0,05; ** – p<0,005 *** – p<0,0005 Fig. 2. CRISPR/Cas9 knockout of NSD1 gene in laryngeal squamous cell carcinoma and lung adenocarcinoma cancer cells.

The evaluation of the NSD1 knockout efficiency by western blotting, A – NSD1 protein expression in JHU 011, JHU 022 and A549 cell lines; B – H3K36me2 level in JHU 011, JHU 022 and A549 cell lines; C – Quantification of H3K36me2level in JHU 011, JHU 022 and A549 cell lines upon NSD1 knockout; Vinculin and H3 were used as a loading control. Data variability is presented as standard error of the mean (m ± SEM; n=3). Mann–Whitney U-test: * – p<0.05, ** – p<0.005, *** – p<0.0005

экспрессии генов [17]. Для создания клеточных моделей нами были выбраны две клеточные линии ВПЧ-отрицательного плоскоклеточного рака гортани – JHU 011 и JHU 022. Также в качестве дополнительной модели исследования было решено создать клеточную модель немелкоклеточного рака легкого с нокаутом NSD1, чтобы оценить влияние данной ГМТ на этиологически близкий раку гортани тип опухоли. Для этого была выбрана клеточная линия A549 (аденокарцинома).

После финальной стадии получения нокаут-ных клеточных линий, моноклональной селекции клеток, мы оценили эффективность нокаута NSD1 с помощью иммуноблоттинга (рис. 2А). После окрашивания антителами против белка NSD1 был детектирован сигнал в контрольных клетках, которые были трансфецированы плазмидой, не несущей гидовую РНК (pLenti), и наблюдалось отсутствие сигнала в нокаутных клетках (NSD1 KO) во всех трех клеточных линиях. Учитывая основную функцию белка NSD1 – метилирование лизина в положении 36 гистона 3 (H3K36me2) [18], ‒ также было решено оценить эффективность нокаута посредством иммунодетекции и далее количественной оценки H3K36me2в клеточных лизатах. Из результатов иммуноблоттинга следует, что клеточные линии с нокаутом NSD1 имеют более чем в два раза сниженную экспрессию H3K36me2 (рис. 2Б, 2В). Данные результаты свидетельствуют об эффективности нокаутов в созданных нами клеточных моделях. В результате данной работы были впервые получены клеточные JHU 011, JHU 022 и A549 с нокаутом гена NSD1 (JHU 011 NSD1 KO, JHU 022 NSD1KO и A549 NSD1 KO, соответственно), так как, по литературным данным, такие модели не были описаны ранее.

Влияние нокаута NSD1 на скорость роста клеток плоскоклеточного рака гортани и шеи и аденокарциномы легкого

По результатам теста на пролиферацию было показано, что нарушение экспрессии NSD1 приводит к снижению пролиферативной активности клеток JHU 011 и JHU 022 (рис. 3A). Исследования, демонстрирующие in vitro снижение пролиферации клеток плоскоклеточного рака гортани после нарушения экспрессии NSD1, ранее опубликованы не были. Показано, что функциональные паралоги NSD1 – NSD2 и NSD3 – поддерживают пролиферацию в клетках рака головы и шеи, и снижение их экспрессии ведет к замедлению клеточной пролиферации [19, 20]. В клеточной модели аденокарциномы легкого A549 скорость роста клеток без экспрессии NSD1 увеличилась (рис. 3Б). Исходя из данного факта, можно

А549

100-1

80-

60-

40- pLenti

NSD1 КО

20-

96 120 144 168

часы hours

плоскоклеточного рака гортани и аденокарциномы легкого. Кривые относительного уровня пролиферации клеток в течение 168 ч: А – клеточные линии JHU 011 и JHU022; Б – клеточная линия A549.

Эксперимент выполнен в трех биологических повторах. Вариабельность данных представлена как стандартная ошибка среднего (m ± SEM). Двухфакторный дисперсионный анализ:

* – p<0,05; ** – p<0,005; *** – p<0,0005 Fig. 3. The effect of NSD1 knockout on cell growth in in laryngeal and lung adenocarcinoma cancer cells. The cell proliferation curves for 168 hours. A – cell lines JHU 011 and JHU022; B – A549 cell line. The experiment was performed in three biological repeats. Data variability is presented as standard error of the mean (m ± SEM). Two-way ANOVA:

* – p<0.05, ** – p<0.005, *** – p<0.0005

предположить, что роль NSD1 в росте клеток варьируется в зависимости от типа опухоли.

Анализ изменения чувствительности клеток плоскоклеточного рака гортани и клеток аденокарциномы легкого к цисплатину при нокауте NSD1

Влияние нокаута NSD1 на изменение чувствительности клеток JHU 011 к лечению цисплатином оценивали посредством вычисления полуингибирующей концентрации (IC50). По результатам трех независимых биологических повторов IC50 цисплатина для клеток JHU 011 с ненарушенной экспрессией NSD1 составила 0,28 мкМ, в то время как клетки JHU 011 NSD1 KO продемонстрировали усиление чувствительности к лечению цисплатином в 1,87 раза, имея IC50 0,15мкМ (рис. 4А). Статистически значимого влияния нокаута NSD1 на чувствительность к цисплатину в клетках аденокарциномы легкого А549 обнаружено не было (рис. 4Б).

Полученные данные свидетельствуют о том, что наличие мутации NSD1 может коррелировать с повышенным ответом на цисплатиновую терапию. Полученные нами данные находят подтверждение в литературе. Ряд исследований демонстрирует,

Риc. 4. Влияние нокаута NSD1 на чувствительность клеток плоскоклеточного рака гортани и аденокарциномы легкого к цисплатину. Кривые полуингибирующей концентрации цисплатина и оценка изменения средней полуингибирующей концентрации по результатам трех независимых биологических повторов: А – клеточная линия JHU 011; Б – клеточная линия A549. Вариабельность данных представлена как стандартная ошибка среднего (SEM; n=3), непараметрический критерий Манна–Уитни: * – p<0,05; ** – p<0,005; *** – p<0,0005; ns – отличия статистически не значимы

Fig. 4. The effect of NSD1 knockout on cisplatin treatment response of laryngeal squamous cell carcinoma and lung adenocarcinoma cells. The half-maximal inhibitory concentration curves for cisplatin and the evaluation of half-maximal inhibitory concentration changing upon NSD1 knockout. The experiment was performed in three biological repeats. A – JHU 011 cell line; B – A549 cell line. Data variability is presented as standard error of the mean (m ± SEM; n=3). Mann–Whitney U-test:

* – p<0.05, ** – p<0.005, *** – p<0.0005; ns – not statistically significant что при нарушении экспрессии NSD1 в клеточных линиях рака головы и шеи (FaDu, UM-SCC47, Cal33) до 50 % увеличивается чувствительность к цисплатину [10, 11], а также к карбоплатину [10].

Также можно сделать вывод, что этот эффект не является просто следствием замедляющегося роста клеток с подавленной экспрессией NSD1, так как, согласно кривым роста, можно отметить, что значительные расхождения в пролиферативной активности клеток детектируются, начиная с 96-ч инкубации, в то время как инкубация с цисплатином велась в течение 72 ч, по истечении которых детектировался результат.

Заключение

В данной работе впервые получены клеточные линии плоскоклеточного рака гортани JHU 011, JHU 022 с нокаутом гена NSD1 . В полученных клеточных моделях было продемонстрировано in vitro , что нарушение экспрессии NSD1 ведет к