Новое моноклональное антитело для детекции опухоль-ассоциированного белка PMEPA1

PMEPA1 (Prostate Transmembrane Protein, белком, обратившим на себя внимание исследова-Androgen Induced 1) является трансмембранным телей в связи с его вовлеченностью в сигнальный путь трансформирующего фактора роста β (TGF-β) [2, 8]. Сигнальный путь TGF-β играет ключевую роль в процессах клеточного роста, дифференцировки, апоптоза, вовлечен в регуляцию иммунного ответа, формирование злокачественных опухолей и их метастазирование. TGF-β функционирует как промотор опухолевой прогрессии путем индукции эпителиально-мезенхимального перехода, в результате которого опухолевые клетки приобретают способность к метастазированию [7]. Механизмы, лежащие в основе рецепторной активации и экспрессии генов, вовлеченных в сигнальные пути гена TGF-β, широко освещены в литературе [12]. Одним из белков, чья экспрессия непосредственно индуцируется в результате активации TGF-β сигнального пути, является PMEPA1 [2]. Кроме того, известно, что PMEPA1 может непосредственно связываться с молекулами R-Smad (Smad 2 и 3), которые являются посредниками в передаче сигнала от молекулы рецептора TGF-β в ядро, тем самым блокируя трансдукцию сигнала [14, 15].

Анализ имеющихся в литературе данных о функции белка PMEPA1 определил его важное значение в процессах пролиферации и дифференцировки ряда тканей эпителиального происхождения, что позволило говорить о роли PMEPA1 в развитии злокачественных новообразований различных локализаций. Существующие разрозненные данные свидетельствуют в пользу весьма неоднозначной роли данного белка в онкогенезе, требующей более детального уточнения. Повышенная экспрессия гена PMEPA1 в опухолевой ткани отмечается у больных раком почки, легкого, толстой кишки, поджелудочной железы, яичников и молочной железы [2, 3, 7, 10]. При сравнении полнотранскрип-томных профилей инвазивных опухолей простаты с нормальными тканями (или преинвазивными опухолями) было обнаружено, что PMEPA1 высоко экспрессируется в тканях опухолей, склонных к инвазивному росту. Соответственно, повышение его экспрессии ассоциировано с плохим прогнозом клинического течения заболевания [14]. В то же время другие авторы, исследующие роль PMEPA1 при раке простаты, приводят данные об увеличении вероятности прогрессии заболевания при снижении экспрессии PMEPA1 [6]. Вероятно, критическую роль при этом играют изменения рецепторного аппарата к андрогенам, которые наряду с TGF-β напрямую регулируют экспрессию PMEPA1 в ткани простаты. Исходя из того, что существуют некоторые органоспецифичные особенности характера экспрессии PMEPA1, необходимо уточнение его роли при каждой отдельной локализации злокачественного процесса.

В имеющейся литературе нам не удалось обнаружить информацию по исследованию белковой экспрессии PMEPA1 в операционном клиническом материале, а соответственно, и о коммерчески доступных антителах, обладающих специфичностью для достоверной детекции PMEPA1 в тканях. В то же время проведенные нами предварительные исследования показали неэффективность использования ряда коммерческих антител для детекции PMEPA1 в экстрактах тканей и на гистологических срезах.

Это обусловило актуальность получения высокоспецифичных антител к PMEPA1, которые бы могли детектировать этот белок в клинических образцах биологического материала.

Цель исследования: получение нового моноклонального антитела к опухоль-ассоциированному белку PMEPA1 и подтверждение его специфичности.

Материал и методы

Получение гибридов мкАТ против PMEPA1. В качестве антигена при иммунизации крыс использовался синтетический пептид 275WSKEKDKQKGHPL287, конъюгированный с бычьим сывороточным альбумином и овальбумином (PSL, Германия). Подкожная и внутрибрюшинная иммунизация проводилась смесью 50 мкг пептида, 500 мкл фосфатно-солевого буфера и 500 мкл неполного адъюванта Фрейда (НАФ), содержащей 5 nM CpG олигонуклеотода (Tib Mol-biol, Германия). Спустя шесть недель проводилась повторная иммунизация раствором, не содержащим НАФ. Гибридизация лимфоцитов проводилась по стандартной методике [11]. мкАТ, показывающие специфическую активность против PMEPA1, подвергались дальнейшему анализу с помощью иммуноблота.

Очистка полученных мкАТ. Перед нанесением образца сорбент уравновешивали фосфатносолевым буфером (5 объемов хроматографической колонки), рН 7,2–7,4 до выхода оптической плотности, проводимости и рН на постоянные значения. Культуральную жидкость наносили на сорбент MabSelect Sure со скоростью 0,25 мл/мин. По окончании нанесения сорбент промывали стартовым буфером (5 объемов хроматографической колонки) со скоростью 0,5 мл/мин. Белок элюировали буфером, содержащим 50 мМ CH₃COONa и 100 мМ L-Арг, pH 2,8, который подавали на колонку реверсивным током. Фракцию, содержащую целевое мкАТ, собирали в стерильный флакон и доводили рН до 6,5–7,0 раствором 2М Tris.

Получение рекомбинантного белка PMEPA1 в культуре клеток линии HEK293T. Полноразмерный ген PMEPA1 амплифицировали с использованием специфических праймеров, в состав которых вводили сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции Nhe1 и EcoR1 и клонировали в плазмиду pIRES-EGFP (Clontech, США). Трансфекция проводилась кальций-фосфатным методом.

Иммуноблотинг . Клеточные лизаты подвергали электрофоретическому разделению по методу Лэммли в градиентном полиакриламидном геле (10–20 %). После разделения белки подвергали электропереносу на поливинил-дифторидную мембрану Immobilon-P Transfer Membrane (Millipore, США), используя Mini Trans-Blot transfer cell (Bio-Rad, США) в соответствии с рекомендациями производителя. При исследовании образцов специфическую реакцию определяли на пленке для выявления хемолюминесценции с помощью ECL Plus Western Blotting Detection System.

Иммуноцитохимическое исследование. Способность полученных мкАТ к связыванию белка PMEPA1 была проанализирована с помощью иммуноцитохимии. Клетки, выращенные на покровных стеклах, промывали фосфатно-солевым буфером. Фиксация и пермеабилизация проводились абсолютным ацетоном при –20°C в течение 5 мин. В качестве вторичных антител использовали овечьи антитела к IgG кролика, конъюгированные с родамином в разведении 1:300. Визуализация проводилась с помощью флуоресцентного микроскопа Axioimager Z1 с системой для улучшения контрастности ApoTome (Carl Zeiss, Германия). Изображения регистрировали с помощью камеры AxioCam MRm (Carl Zeiss, Германия).

Иммуногистохимическое исследование . В качестве материала для тестирования использовали депарафинизированные срезы тканей рака простаты 2 пациентов. Операционный материал фиксировали 10 % формалином, забуференным фосфатным буфером в течение 24 ч. Связавшиеся антитела выявляли, используя козьи антитела против первичных антител, конъюгированные с пероксидазой хрена, в разведении 1:100, раствор которых наносили на срезы на 30 мин. Для визуализации специфической реакции использовали Liquid DAB (Dako, Дания).

Результаты и обсуждение

Получение мкАТ, обладающих специфичностью к опухоль-ассоциированному белку PMEPA1. Первоначально PMEPA1 был идентифицирован как ген, экспрессия которого находится под контролем стероидных гормонов в ткани предстательной железы [16]. Основной белковый продукт гена PMEPA1 содержит 287 аминокислотных остатков, являясь самой длинной формой, состоит из экстрацеллюлярного домена (40 аминокислот), трансмембранного домена (28 аминокислот) и длинного цитоплазматического «хвоста» (227 аминокислот) (рис. 1).

Для получения специфичных к PMEPA1 мкАТ нами был выполнен поиск участков локализации антигенных детерминант, топологически наиболее доступных для взаимодействия антител с выявленным мембранным белком. В качестве антигена использовался синтетический пептид 275WSKEKDKQKGHPL287, представляющий собой C-концевую цитоплазматическую часть белка PMEPA1 (рис. 1). Полученные мкАT были очищены с помошью сорбента MabSelect (GE Healthcare, США) и протестированы на способность специфически связывать рекомбинантный белок PMEPA1 в лизатах клеток линии Hek293T, транзиентно экпрессирующих PMEPA1 (рис. 2).

Тестирование специфичности полученных мкАТ против белка PMEPA1. Клетки линии Hek293T трансфецировали экспрессионным векто-

10	20	30	40	50	60
MHRLMGVNST	AAAAAGQPNV	SCTCNCKRSL	FQSMEITELE	FVQIIIIVW	MMVMVWITC
70	80	90	100	110	120
LLSHYKLSAR	SFISRHSQGR	RREDALSSEG	CLWPSESTVS	GNGIPEPQVY	APPRPTDRLA
130	140	150	160	170	180
VPPFAQRERF	HRFQPTYPYL	QHEIDLPPTI	SLSDGEEPPP	YQGPCTLQLR	DPEQQLELNR
190	200	210	220	230	240
ESVRAPPNRT	IFDSDLMDSA	RLGGPCPPSS	NSGISATCYG	SGGRMEGPPP TYSEVIGHYP
250	260	270	230
GSSFQHQQSS	GPPSLLEGTR	LHHTHIAPLE	SAAIWSKEKD KQKGHPL

Рис. 1. Аминокислотная последовательность канонической формы PMEPA1, синтезированный фрагмент выделен жирным шрифтом

Рис. 2. Схема строения экспрессионной плазмиды pIRES-EGFP-PMEPA1

kDa 5 ng 2,5 ng control

dimeric form of PMEPA1

PMEPA1 isoform 1 (32 kDa)

PMEPA1 isoform 2 (27 kDa)

Рис. 3. Результат вестерн-блот анализа лизата трансфецированных клеток линии Hek293T различным количеством экспрессионного вектора ром pIRES-EGFP, содержащим вставку, кодирующую полноразмерный белок PMEPA1, после чего лизировали RIPA буфером. Методом вестерн-блот анализа проводили детекцию целевого белка с использованием полученных мкАТ. На рис. 3 видно, что мкАТ, помимо связывания с двумя изоформами

Рис. 4. Иммуногистохимическое исследование экспрессии белка PMEPA1 в ткани простаты с использованием полученных мкАТ, ×200

PMEPA1, специфически связывают белок, молекулярная масса которого приблизительно равна 65 kDa. Вероятно, этот бэнд соответствует димерной форме белка PMEPA1. В литературе нет достоверных сведений о функциональной димеризации PMEPA1, однако известно, что другие мембранные белки, имеющие сходную структуру, обладают такой способностью [1].

Способность полученных антител распознавать целевой белок в клетках линии HEK293T оценивали с помощью метода иммуноцитохимии. Визуализацию проводили с помощью антивидовых конъюгатов, меченных родамином. Трансфецированные клетки, содержащие генетическую конструкцию pIRES-EGFP-PMEPA1, характеризовались более высоким уровнем флуоресценции, по сравнению с нетрансфецированными контрольными клетками. В иммуноцитохимическом исследовании мкАТ выявляют цитоплазматическую локализацию белка PMEPA1.

Для оценки специфичности и пригодности применения полученных мкАТ для детекции PMEPA1 в клинических образцах нами был использован иммуногистохимический анализ срезов ткани из парафиновых срезов (рис. 4). В качестве положительного контроля, то есть ткани, имеющей стабильно высокую экспрессию белка PMEPA1, была выбрана нормальная ткань простаты [16]. Из рис. 4 видно, что наблюдается выраженная ядерно-цитоплазматическая экспрессия PMEPA1. Локализация белка PMEPA1 в непосредственной близости от аппарата Гольджи, которая визуализируется как ядерно-цитоплазматическое окрашивание, отмечалась и в исследованиях экспрессии PMEPA1 в других типах тканей [9].

Заключение

Нами получено новое моноклональное антитело против опухоле-ассоциированного белка PMEPA1, вовлеченного в TGF-β сигнальный путь, играющего важную роль в процессе эпителиально- мезенхимального перехода. Полученные мкАТ обладают достаточной чувствительностью для детекции PMEPA1 в клиническом материале и выявления особенностей его экспрессии в различных тканях. Новое антитело может послужить основой для создания коммерческого антитела для тестирования белка PMEPA1 в биологических образцах человека.