Новые цитокининподобные метаболиты Pseudomonas chlororaphis

В последнее время растет интерес к экологически чистым и сравнительно безопасным в применении микробиологическим средствам защиты растений. Основное преимущество биологического метода по сравнению с химическим – отсутствие отрицательного влияния на окружающую среду.

Фитогормоны играют важную роль как регуляторы роста и развития растений. Использование природных фитогормонов микробного происхождения в растениеводстве весьма перспективно ввиду простоты их получения, сравнительной дешевизны, высокой способности их к детоксикации в растительном организме, а также способности легко связываться в клетке и катаболизироваться. Кроме того, с помощью микробов можно получить фитогормональные соединения со структурой, отличной от структуры коммерческих препаратов, но обладающие более высокой биологической активностью, которые сложно получить путём химического синтеза [1].

Некоторые представители бактерий рода Pseudomonas с пособны стимули ровать рост и развитие растений, в связи, с чем разработка и внедрение в сельскохозяйственную практику биологических препаратов на их основе приобретает особое значение.

Целью настоящей работы было изучение химической природы новых метаболитов c фитогормональной активностью штамма бактерий P. chlororaphis ИБ6 .

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Объектом исследований являлся штамм бактерий из Коллекции микроорганизмов Института биологии УНЦ РАН P. chlororaphis ( =P. aureofasiens ) ИБ6, обладающий совокупностью полезных для растений свойств, такими как синтез антифунгальных антибиотиков и ростстимули-рующих веществ [2, 3]. Микроорганизмы культивировали в течение 3 сут при температуре 28ºС в жидкой питательной среде, содержащей (г/л): гли-

церин – 20; дрожжевой автолизат – 0,01; Na 2 HPO 4 ×12H 2 O – 10,0; KH 2 PO 4 ×2H 2 O – 0,5; MgSO 4 ·7H 2 O – 1,5; FeCl 3 – 0,01.

Низкомолекулярные фракции (НМФ) метаболитов получали, и выделение отдельных компонентов из них проводили при помощи препаративной ВЭЖХ в системе, состоящей из насоса высокого давления модели 572P (“Gasukuro Kogyo”, Япония), УФ-детектора (“Du Pont”, США). Для разделения использовали колонку из нержавеющей стали с сорбентом Zorbax-ODS (250х21,1 мм, “Shimadzu”, Япония). Образцы вводили с помощью дозатора модели 7125 (“Rheodyne”, США) с петлей объемом 500 мкл. В качестве элюента использовали воду, подвергнутую дополнительной очистке, при скорости элюции 10,0 мл/мин. Регистрировали поглощение при длине волны 254 нм [4].

Фитогормональную активность компонентов НМФ определяли известным методом при помощи иммуноферментного анализа [5].

УФ-спектры регистрировали на спектрофотометре Specord M40 (“Carl Zeise”, Германия) в области 200-300 нм (в воде).

Масс-спектры химической ионизации были получены электрораспылением (электроспрей) на квадрупольном жидкостном хромато-масс-спектрометре LCMS-2010 EV (“Shimadzu”, Япония) (шприцевой ввод, раствор образца в ацетонитриле или в воде при расходе 60 мкл/мин, элюент – ацетонитрил/вода в соотношении 50/50).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее были выявлены параметры питательной среды для культивирования бактерий P. chlororaphis ИБ6, позволяющие получать культуральную жидкость этих бактерий с концентрацией цитокининов свыше 1100 нг/мл, при этом также наблюдалась ее высокая антигрибная активность [4].

Хроматографический профиль НМФ образца с максимальной фитогормональной активностью был представлен 3 компонентами, один из которых обладал антигрибной активностью, два других – вещества цитокининовой природы (рис. 1а).

При хроматогафическом разделении компонент с антигрибной активностью первым элюировал с колонки и не имел ярко выраженного максимума

Биотехнология поглощения в УФ-области. Остальные компоненты фракции имеют максимумы УФ- поглощения в интервале от 255 до 280 нм, характерные для регуляторов роста растений, что и было подтверждено данными иммуноферментного анализа. Причем максимум поглощения одного из исследуемых компонентов находился при длине волны 267 нм (рис. 1б), можно было предположить, что это цитокинин зеатин, а максимальная абсорбция другого компонента цитокининовой природы наблюдалась при 257,5 нм (рис. 1в).

В дальнейшем методом хромато-масс-спектроскопии было подтверждено предположение о том, что один из компонентов с фитогормональной активностью является зеатином, ему соответствует пик с максимумом отношения массы к заряду, равным 220 (рис. 2а).

Структура другого компонента представляется более интересной и новой для веществ цитокининовой природы.

В результате интерпретации масс – спектра ее можно представить как трипропионил - N6 - (Δ2 -изопентенил)аденозин (рис. 2б), которому соответствует пик с отношением массы к заряду, равным 504. В спектре присутствуют фрагменты оснований цитокининов с m/z 136 (аденин), 204 (N6 - (Δ2 - изопентенил)аденин).

Наличие трипропионилрибозы обусловлено фрагментом с m/z 301, дальнейшее отщепление от которой двух молекул пропионовой кислоты приводит к фрагменту с m/z 153, последующее отщепление метилкетеновой группы – к фрагменту с m/z 97.

а

нм                        нм

б

в

Рис. 1. Хроматографический профиль (а) НМФ КЖ штамма P. chlororaphis ИБ 6, компоненты фракции: 1 – с антигрибной активностью, 2, 3 – с фитогормональной активностью, и УФ – спектры метаболитов, выделенных из НМФ: б – компонента 2, в – компонента 3.

а

б

Рис. 2. Масс-спектры компонентов с фитогормональной фракции метаболитов КЖ штамма P. chlororaphis ИБ 6.

Прим.: а – компонента 2 из рис. 1а, б – компонента 3 из рис. 1а.

Таким образом, выявлены условия максимальной продукции штаммом P. chlororaphis ИБ 6 веществ цитокининовой природы, позволяющие получать культуральную жидкость этих бактерий с концентрацией цитокининов свыше 1100 нг/мл, представленных в том числе и трипропионил - N6 - (Δ2 - изопентенил)аденозином – новой формой цитокининоподобных веществ.