Новые галотолерантные штаммы-деструкторы бифенила рода Rhodococcus

Активное развитие химической и электротехнической промышленности в XX в. привело к загрязнению обширных территорий особо опасными для животных и человека соединениями ароматического ряда – полихлорированными бифенилами (ПХБ). Полихлорированные бифенилы отличаются повышенной устойчивостью к деструктивному действию физических и химических факторов (высокие и низкие температуры, воздействие кислот и щелочей). Согласно Стокгольмской Конвенции , полихлорированные бифенилы должны быть полностью выведены из производства; обширные территории, загрязненные данными поллютантами подлежат восстановлению, а ПХБ, находящиеся в местах складирования, должны быть утилизированы. Основную роль в разложении ПХБ в естественных условиях играет бактериальная микрофлора почв и донных отложений (Unterman, 1996; Pieper, 2005; Васильева, Стрижакова, 2007; Seeger, Pieper, 2010).

В течение последних десятилетий описано значительное количество бактерий, принадлежащих родам Pseudomonas, Burkholderia, Comamonas, Sphyngomonas, Rhodococcus, Bacillus, осуществляющих деструкцию ПХБ (Unterman, 1996; Seeger, Pieper, 2010). Стоит отметить, что известно лишь несколько штаммов, эффективно разлагающих широкий спектр полихлорированных бифенилов (Billingsley et al., 1997; Kim, Picardal, 2001; Pieper, 2005). Активность штаммов по отношению к ПХБ обусловливается наличием метаболических систем разложения незамещенного бифенила (Martinkova et al., 2008; Seeger, Pieper, 2010). В связи с этим целесообразен поиск новых штаммов-деструкторов ПХБ на основе отбора штаммов, способных активно утилизировать бифенил.

В реальных условиях загрязнение окружающей среды носит комбинированный характер. Присутствие в почвах широкого спектра органических поллютантов, а также таких экстремальных факторов как повышенная минерализация, присутствие тяжелых металлов, высокий или низкий уровень рН – обусловливает стресс у бактерий и приводит к ингибированию процессов деструкции ароматических соединений (Martinkova et al., 2008). В связи с вышесказанным, бактерии, обладающие устойчивостью к стрессовым условиям среды и высокой деструктивной активностью по отношению к органическим поллютантам, представляют интерес для использования их в экобиотехнологиях.

Цель работы – изучение грамположительных бактерий-деструкторов бифенила, выделенных из техногенно-минеральных образований (Березники, Пермский край).

Материалы и методы

В работе использовали минеральную среду Раймонда (г/л): NH 4 NO 3 – 2.0, MgSO 4 × 7H 2 O – 0.2, KH 2 PO 4 – 2.0, Na 2 HPO 4 – 3.0, Na 2 CO 3 – 0.1, CaCl 2 × 6H 2 O – 0.01 (Розанова, Назина, 1982) и ее модификации: а) с добавлением 5 г/л триптона и 2.5 г/л дрожжевого экстракта – в качестве полноценной среды; б) с добавлением FeSO 4 ∙7H 2 O – 0.001 г/л,

MnSO 4 ∙5H 2 O – 0.002 г/л – в качестве минеральной среды при исследовании ростовых характеристик чистых культур. NaCl вносили в среды до конечной концентрации (%): 3, 5, 6, 9. Для получения агаризованных сред вносили агар («Sigma») 15 г/л.

Выделение штаммов деструкторов проводили методом накопительного культивирования. Образцы техногенно-минеральных образований (ТМО) (10 г/л) были помещены в 250 мл колбы с 100 мл основной среды Раймонда (3% NaCl) с бифенилом, в качестве ростового субстрата. Накопительные культуры инкубировали в течение 1 месяца на термокачалке (100 об/мин) при температуре 28˚С. Чистые культуры штаммов-деструкторов выделяли путем высева из накопительных культур на ага-ризованную среду Раймонда с 3% NaCl с бифенилом, чистоту культур контролировали путем высева на полноценную агаризованную среду Раймонда (3% NaCl).

Морфологические и физиологические признаки микроорганизмов изучали по общепринятым методикам (Методы…, 1983; Методы…, 1991). Амплификацию генов 16S рРНК проводили с использованием бактериальных праймеров 27F и 1492R (Tiirola et al., 2002). Секвенирование продуктов амплификации осуществляли с помощью набора реактивов DYEnamic ET Dye Terminator Cycle sequencing Kit на автоматическом секвенаторе MegaBASE 1000 (JSC GE Healthcare, США) согласно рекомендациям производителя. Полученные нуклеотидные последовательности анализировали с использованием программ CLUSTAL W (Thompson et al., 1994), TREECON (van de Peer, DeWachter, 1994), BLAST . Поиск гомологичных последовательностей производили по базам данных GenBank и EzTaxon .

Ростовые характеристики штаммов изучали в жидкой минеральной среде Раймонда (3% NaCl) с бифенилом (1г/л) в качестве источника углерода и энергии. Штамм выращивали в колбах Эрленмейе-ра объемом 250 мл в 100 мл минеральной среды при температуре 28 ° С и аэрации на шейкере со скоростью 120 об/мин. Оптическую плотность культур измеряли на спектрофотометре BioSpec-mini (Shimadzu) при длине волны 540 нм. Расчет удельной скорости роста (μ) культуры и время удвоения (t d ) производили по стандартным формулам.

Устойчивость бактерий к содержанию в среде культивирования NaCl определяли на агаризован-ной и в жидкой минеральных средах с бифенилом (1 г/л) в качестве ростового субстрата. Концентрация хлорида натрия в среде составляла от 0 до 9%. Рост бактерий учитывали на седьмые сутки.

Субстратную специфичность штаммов изучали при выращивании на минеральной среде Раймонда с 3% NaCl (Плотникова и др., 2006). В качестве единственного источника углерода и энергии использовали фенантрен, нафталин, бифенил и ряд карбоновых кислот: бензойную, гентизиновую, пара -гидроксибензой-ную (ПГБК), 2- и 4-хлорбен-зойные (2ХБК, 4ХБК), орто -фталевую.

Все эксперименты проводили в трехкратной повторности. Полученные данные обрабатывали с использованием стандартных пакетов компьютерных программ Microsoft Excel.

Результаты и обсуждение

Методом накопительного культивирования из образцов ТМО были выделены шесть штаммов бактерий. Штаммы ЕК-7, ЕК-8, ЕК-9, ЕК-10, ЕК-11 и ЕК-12 при росте на полноценной среде формировали круглые колонии с гладкой, блестящей поверхностью, непрозрачные, светло-бежевые, с гладким краем. Изолированные бактерии – аэробы, клетки неподвижные, не образуют спор, характеризуются выраженной каталазной активностью. Для исследуемых бактерий характерен трехстадийный морфогенетический цикл развития (кокки – палочковидные, нитевидные или ветвящиеся клетки – кокки).

У штаммов ЕК-7, ЕК-8, ЕК-9, ЕК-10 и ЕК-11 определены нуклеотидные последовательности фрагментов гена 16S рРНК длиной 666, 589, 511, 682 и 582 п.н., соответственно, и проведено их сравнение с гомологичными последовательностями, имеющимися в базах данных Gen-Bank/EMBL/DDBJ и на сервере EzTaxon. Выявлена филогенетическая близость штаммов ЕК-7 и ЕК-10 с типовым штаммом Rhodococcus wratisla-vensis NCIMB 13082^Т, штаммов ЕК-9, ЕК-11 – с Rhodococcus opacus DSM 43205^T, штамма ЕК8 – с Rhodococcus percolatus MBS1^T. На данном этапе исследований изолированные бактерии отнесены к роду Rhodococcus .

Изучена способность штаммов к росту моно- и полиароматических углеводородах (табл. 1). Известно, что представители рода Rhodococcus способны разлагать широкий спектр органических поллютантов, в том числе, ароматические углеводороды и их хлорированные производные (Seto et al., 1995; Martinkova et al., 2008). Изолированные нами штаммы проявляли способность использо- их хлор- и гидроксипроизводные (4ХБК, 2ХБК, ПГБК). Установлено, что штаммы ЕК-7, ЕК-8, ЕК-9, ЕК-10 и ЕК-12 способны расти в жидкой минеральной среде Раймонда (3% NaCl) с бифенилом в вать в качестве единственного источника углерода и энергии моно- (бензойная, гентизиновая, орто-фталевая кислоты) и полиароматические (фенантрен, нафталин, бифенил) углеводороды, а так же

качестве единственного источника углерода и энергии (рисунок). Рост культур характеризовался непродолжительной подготовительной фазой.

Таблица 1

Рост штаммов рода Rhodococcus на ароматических субстратах

Штамм	Фенантрен	Бифенил	Нафталин	Бензоат	Генти-зат	о -фталат	ПГБК	4ХБК	2ХБК
ЕК-7	++	++++	++	+	++	+++	++++	+	++
ЕК-8	++	++++	++	+	++	++++	++++	+	++
ЕК-9	++	++++	++++	+++	++++	++++	++++	+++	++
ЕК-10	++	++++	+++	+	++	++	++++	+	++
ЕК-11	++	++++	+++	+	++	++	++++	+	++
ЕК-12	++	++++	++	+	++	++	++++	+	++

«++++» – колонии размером более 0.3 см, «+++» – колонии размером 0.2–0.3 см, «++» – колонии размером 0.1–

0.2 см, «+» – колонии размером менее 0.1 см.

Рост штаммов Rhodococcus sp. на бифениле (1г/л) в качестве единственного источника углерода и энергии при 3% NaCl в среде:

1 – ЕК-10; 2 – К-9; 3 – ЕК-12; 4 – ЕК-7; 5 – ЕК-8

Для всех исследуемых штаммов была отмечена значительная оптическая плотность культуры при достижении стационарной фазы роста (ОП 540 1.0 – 1.2 ед.).

В табл. 2 приведены параметры роста родокок-ков в минеральной среде с бифенилом. Высокая удельная скорость роста штаммов свидетельствует об эффективном использовании бифенила в качестве ростового субстрата.

Физиологические характеристики роста исследуемых штаммов сопоставимы с таковыми параметрами описанного нами ранее штамма-деструктора ПХБ Rhodococcus ruber Р25 (=ИЭГМ 896) (Рыбкина, 2003).

Изучено влияние NaCl на способность изолированных штаммов использовать бифенил в качестве источника углерода и энергии (табл. 3).

Таблица 2

Ростовые характеристики штаммов-деструкторов бифенила

Штамм	Удельная скорость роста, ч 1	Время удвоения, ч
ЕК-7	0.069±0.002	10.0±0.1
ЕК-8	0.053±0.002	13.0±0.2
ЕК-9	0.046±0.004	15.0±0.2
ЕК-10	0.064±0.003	10.5±0.1
ЕК-12	0.069±0.005	10.0±0.1

Установлено, что максимальный уровень минерализации, при котором штаммы проявляли свои деструктивные свойства, при культивировании в жидкой среде составил 5%, а на агаризован-ной – 6%. В литературе встречаются лишь единичные сведения по бактериальному разложению бифенила в условиях повышенной минерализации среды. Так известно, что штамм Dyella ginsengisoli LA-4 использовал бифенил как ростовой субстрат при содержании NaCl в среде до 3% и проявлял деструктивные свойства по отношению к данному субстрату при минерализации среды до 10% (Li et al., 2009). Для штаммов рода Rhodococcus способность расти на бифениле в жидкой минеральной среде, в присутствии высоких концентраций хлорида натрия описана впервые. В тоже время, известны факты разложения родококками бензола и нафталина в условиях повышенной осмолярности среды (Luz et al., 1997, Плотникова и др., 2001, 2006).

Следует отметить, что исследуемые штаммы растут в минеральных средах с бифенилом как в присутствии хлорида натрия, так и в его отсутствие. Данные результаты позволяют отнести исследуемые штаммы к галотолерантным микроорга- низмам, по классификации Кашнера (Кашнер, 1981).

Таблица 3

Рост штаммов рода Rhodococcus на бифениле при различном содержании NaCl в среде

Штамм	Содержание NaCl в агаризованной среде, %				Содержание NaCl в жидкой среде, %
	0	3	6	9	0	3	5	6
ЕК-7	++++*	++++	++	–	++++**	++++	+	–
ЕК-8	++++	++++	++	–	++++	++++	+	–
ЕК-9	++++	++++	++	–	++++	++++	+	–
ЕК-10	++++	++++	++	–	++++	++++	+	–
ЕК-11	++++	++++	++	–	++++	++++	+	–
ЕК-12	++++	++++	++	–	++++	++++	+	–

* «++++» – колонии размером более 0.3 см, «+++» – колонии размером 0.2–0.3 см, «++» – колонии размером 0.1– 0.2 см, «+» – колонии размером менее 0.1 см, «–» – нет роста, ** «++++» – ОП₅₄₀ > 1.5; «+++» – ОП₅₄₀ 1.0–1.5; «++» – ОП 540 0.5–1.0; «+» – ОП 540 < 0.5; «–» – нет роста.

Заключение

На современном этапе развития технологий восстановления загрязненных территорий становится очевидным тот факт, что эффективная очистка почв возможно только при использовании в составе биопрепаратов бактериальных штаммов, проявляющих свои деградативные свойства в отношении поллютантов не только в оптимальных, но и в экстремальных условиях.

Выделенные галотолерантные штаммы Rhodo-coccus sp. ЕК-7, ЕК-8, ЕК-9, ЕК-10, ЕК-11 и ЕК-12 обладают широким спектром деградативной активности в отношении ароматических соединений. Установлено, что исследуемые штаммы используют в качестве ростовых субстратов как моно-, так и полиароматические углеводороды, а также их хлор- и гидроксипроизводные. Особый интерес представляет тот факт, что штаммы утилизируют бифенил в условиях осмотического стресса, вызванного повышенным содержанием хлорида натрия в среде культивирования.

Полученные результаты свидетельствуют о высоком потенциале описанных штаммов для использования в биотехнологиях очистки окружающей среды от ароматических соединений. Будут продолжены исследования по изучению деструктивных свойств изолированных штаммов Rhodo-coccus spp. в отношении полихлорированных бифенилов.

Работа поддержана грантами ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» и Программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».