Новые маркеры для исследования пролиферации Т-лимфоцитов человека

Т-лимфоциты играют важную роль в формировании иммунного ответа [Zhu, Paul, 2008]. Благодаря пролиферации в периферических лимфоидных органах они быстро увеличивают свою численность для эффективной борьбы с патогенами [Liao et al., 2016]. Нарушение в процессе деления Т-клеток приводит к возникновению различных патологий, в т.ч. опухолевых, хронических инфекционных [Chou, Effros, 2013] и аутоиммунных заболеваний [Moulton, Tsokos, 2011]. Наиболее широко используемым методом исследования пролиферации лимфоцитов является проточная цитометрия с оценкой экспрессии маркера Ki67 [Scholzen, Gerdes, 2000]. Следует отметить, что внутриклеточная локализация этой молекулы обусловливает необходимость фиксации и пермеабилизации клеточных мембран [Jamur, Oliver, 2010], что исключает возможность дальнейшей оценки функционального состояния делящихся лимфоцитов. В связи с этим отказ от фиксации/пермеабилизации клеток и поиск поверхностных молекул-аналогов Ki67 представляется актуальным. Перспективным кандидатом на роль такой молекулы является рецептор трансферрина 1 (CD71).

Цель настоящей работы – исследование возможности использования CD71 в качестве альтернативного маркера пролиферации Т-лимфоцитов.

Материалы и методы исследований

Получение биологического материала

План работы был одобрен локальным этическим комитетом (рег. № комитета IRB00008964); каждый обследованный подписал форму информированного согласия. В исследование были приглашены 10 относительно здоровых добровольных доноров крови. Большинство участников (80%) составили женщины. Средний возраст обследованных составил 25 лет.

Забор крови осуществляли из кубитальной вены в пробирки, обработанные антикоагулянтом. Моно-нуклеарные клетки получали путем центрифугирования (400 g, 40 мин) крови в градиенте плотности диаколла ρ = 1.077 (Диаэм; Россия). Полученные образцы подвергали контролируемому замораживанию до –80ºС в течение суток в среде, содержащей 90% инактивированной теплом эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС; Gibco; США) и 10% диметилсульфоксида (MP Biochemicals; США), после чего переносили в жидкий азот для длительного хранения.

Постановка культур

Мононуклеарные клетки периферической крови размораживали и использовали для постановки культур. Лейкоциты культивировали в полной питательной среде (10% ЭТС, 100 Ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (Sigma, США) в RPMI-1640 (Sigma, США)) в концентрации 2×106/мл. Образцы стимулировали фитогемагглютинином (ФГА; Serva, Германия) в конечной концентрации 15 мкг/мл. В качестве контроля использовали клетки без добавления митогена. Полученные лейкоциты инкубировали в пробирках типа эппендорф объемом 2 мл при +37ºС в течение 42 ч.

Цитометрический анализ

Субпопуляционную принадлежность клеток периферической крови определяли с помощью коммерческих флуоресцентных красителей и антител: Zombie UV, CD3 PerCP, CD4 Brilliant Violet 605 (BioLegend, США); CD8 FITC (Dako, Дания); CD45R0 APCe-Fluor780 (eBioscience, США); CD71 Alexa Fluor 700 (Invitrogen, США); Ki67 PE (BD Pharmingen, США).

Цитометрический анализ проводили на приборе CytoFLEX S (Beckman Coulter, США). Для визуализации результатов использовали программу CytExpert (Beckman Coulter, США).

Гейтирование клеток осуществляли с помощью программы FlowJo v10 (FlowJo LLC, США). Из пула анализируемых клеток последовательно выделяли одиночные и жизнеспособные элементы. Т-клетки идентифицировали как CD3-позитивные лимфоциты, которые делили на CD8+ и CD4+ Т-клетки. Степень дифференцировки каждой субпопуляции анализировали по экспрессии CD45R0: CD45R0+ элементы оценивали как Т-лимфоциты памяти, CD45R0– – как наивные Т-клетки. Следует отметить, что среди CD8+CD45R0– Т-лимфоцитов присутствовали как наивные, так и терминально дифференцированные клетки [Akbar et al., 1988].

Статистическая обработка данных

Анализ данных выполнялся методами непараметрической статистики. Рассчитывали медиану и интерквартильный размах (25–75%). Статистическую значимость различий между группами устанавливали на основе U-критерия Манна-Уитни. Корреляционный анализ выполняли по методу Спирмена. Вычис- ления и построение графиков проводили с использованием пакета Microsoft Office и программы GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, США).

Результаты и их обсуждение

Экспрессия Ki67

Стимуляция мононуклеарных лейкоцитов ФГА в течение 42 ч. привела к увеличению доли Т-лимфоцитов, экспрессирующих Ki67. Это наблюдалось в общем пуле Т-клеток (рис. 1А) и в пулах CD4-позитивных (рис. 1Б) и CD8-позитивных (рис. 1В) Т-лимфоцитов.

Рис. 1 . Процентное содержание Ki67-позитивных клеток среди нестимулированных и стимулированных Т-лимфоцитов.

ФГА+ – клетки, стимулированные фитогемагглютинином; ФГА– – нестимулированные клетки. Различия между группами устанавливали с использованием U-критерия Манна-Уитни (*** – P < 0.001). А – все Т-лимфоциты; Б – CD4+ Т-лимфоциты; В – CD8+ Т-лимфоциты

[Percentage of Ki 67-positive cells among unstimulated and stimulated T-lymphocytes.

PHA+ - cells stimulated by phytohemagglutinin; PHA- - unstimulated cells. The differences between the groups were established using the Mann-Whitney U-test (*** - P < 0.001). A – all T-lymphocytes; B - CD4+ T-lymphocytes; C -

CD8+ T-lymphocytes]

Помимо этого, в стимулированных Т-клетках по сравнению с нестимулированными лимфоцитами повысился средний уровень экспрессии молекулы Ki67. Отмеченное изменение не зависело от субпопуляционной принадлежности Т-лимфоцитов и наблюдалось в их общем пуле (рис. 2А) и пулах CD4+ (рис. 2Б) и CD8+ (рис. 2В) Т-клеток.

Рис. 2 . Уровень внутриклеточной экспрессии Ki67 в нестимулированных и стимулированных Т-лимфоцитах.

ФГА+ – клетки, стимулированные фитогемагглютинином; ФГА– – нестимулированные клетки. MFI – медиана интенсивности флуоресценции (median fluorescence intensity). Различия между группами устанавливали с использованием U-критерия Манна-Уитни (** – P < 0.001). А – все Т-лимфоциты; Б – CD4+ Т-лимфоциты; В –

CD8+ Т-лимфоциты

[The level of intracellular expression of Ki67 in unstimulated and stimulated T-lymphocytes.

PHA+ – cells stimulated by phytohemagglutinin; PHA- – unstimulated cells. MFI is the median fluorescence intensity. The differences between the groups were established using the Mann-Whitney U-test (** – P < 0.001). A – all T-lymphocytes; B – CD4+ T-lymphocytes; C – CD8+ T-lymphocytes]

Аналогичные результаты были получены в субпопуляциях различной степени зрелости, в т.ч. наивных Т-клетках и Т-лимфоцитах памяти (табл. 1): после стимуляции среди них выросли доля Ki67-положительных клеток и уровень экспрессии молекулы.

Таблица 1

Отличия экспрессии Ki67 в нестимулированных и стимулированных Т-лимфоцитах различной степени зрелости

[Differences in Ki67 expression in unstimulated and stimulated T-lymphocytes of varying degrees of maturity]

Показатели		CD4+ Т-клетки		CD8+ Т-клетки
		ФГА –	ФГА +	ФГА –	ФГА +
CD45R0–Ki67+ Т-клетки	(%)	1,4 (1,0-2,0) P<0,001	11,6 (4,8-16,6)	1,4 (1,3-2,2) P<0,001	15,4 (5,1-19,8)
CD45R0+Ki67+ Т-клетки	(%)	2,0 (1,8-3,1) P<0,001	9,2 (5,4-13,4)	1,7 (1,6-2,1) P<0,001	10,6 (6,4-15,7)
CD45R0–Ki67+ Т-клетки	(MFI)	6270 (5983-6439) P<0,001	8002 (7686-8090)	6583 (6112-6783) P<0,01	8228 (7198-8683)
CD45R0+Ki67+ Т-клетки	(MFI)	7209 (7098-7300) P<0,01	8573 (8072-9326)	6621 (6234-6868) P<0,05	7899 (7463-8355)

Примечание. Указаны медианы и интерквартильные размахи. ФГА+ – клетки, стимулированные фитогемагглютинином; ФГА– – нестимулированные клетки. MFI – медиана интенсивности флуоресценции (median fluorescence intensity). Статистический анализ – U-критерий Манна-Уитни.

Экспрессия CD71

Анализ экспрессии молекулы CD71 на поверхности нестимулированных и стимулированных Т-лимфоцитов показал следующее. Было обнаружено, что содержание CD71-позитивных Т-клеток повысилось в стимулированных образцах относительно нестимулированных проб. Рост был характерен для общего пула Т-лимфоцитов (рис. 3А) и пулов CD4+ (рис. 3Б) и CD8+ (рис. 3В) Т-клеток.

Рис. 3 . Процентное содержание CD71-позитивных клеток среди нестимулированных и стимулированных Т-лимфоцитов.

ФГА+ – клетки, стимулированные фитогемагглютинином; ФГА– – нестимулированные клетки. Различия между группами устанавливали с использованием U-критерия Манна-Уитни (*** – P < 0.001). А – все Т-лимфоциты; Б – CD4+ Т-лимфоциты; В – CD8+ Т-лимфоциты

[Percentage of CD71-positive cells among unstimulated and stimulated T-lymphocytes.

PHA+ – cells stimulated by phytohemagglutinin; PHA- – unstimulated cells. The differences between the groups were established using the Mann-Whitney U-test (***– P < 0.001). A – all T-lymphocytes; B – CD4+ T-lymphocytes; C – CD8+ T-lymphocytes]

Также после стимуляции увеличился средний уровень экспрессии молекулы CD71, что было отмечено в общем пуле Т-клеток (рис. 4А) и среди CD4-позитивных (рис. 4Б) и CD8-позитивных (рис. 4В) Т-лимфоцитов.

Сходное увеличение доли CD71+ элементов и уровня экспрессии молекулы было зафиксировано в субпопуляциях различной степени зрелости, в т.ч. наивных Т-клетках и Т-лимфоцитах памяти (табл. 2).

Рис. 4 . Уровень поверхностной экспрессии CD71 на нестимулированных и стимулированных Т-лимфоцитах.

ФГА+ – клетки, стимулированные фитогемагглютинином; ФГА– – нестимулированные клетки. MFI – медиана интенсивности флуоресценции (median fluorescence intensity). Различия между группами устанавливали с использованием U-критерия Манна-Уитни (*** – P < 0.001). А – все Т-лимфоциты; Б – CD4+ Т-лимфоциты; В –

CD8+ Т-лимфоциты

[The level of CD71 surface expression on unstimulated and stimulated T-lymphocytes.

PHA+ – cells stimulated by phytohemagglutinin; PHA- – unstimulated cells. MFI is the median fluorescence intensity. The differences between the groups were established using the Mann-Whitney U-test (*** – P < 0.001). A – all T-lymphocytes; B – CD4+ T-lymphocytes; C – CD8+ T-lymphocytes]

Таблица 2

Отличия экспрессии CD71 на нестимулированных и стимулированных Т-лимфоцитах различной степени зрелости

[Differences in CD71 expression on unstimulated and stimulated T-lymphocytes of varying degrees of maturity]

Показатели	CD4+ Т-клетки		CD8+ Т-клетки
	ФГА –	ФГА +	ФГА –	ФГА +
CD45R0–CD71+ Т-клетки (%)	6,0 (3,8-8,5) P<0,001	94,1 (88,1-95,8)	5,3 (2,8-7,0) P<0,001	70,1 (63,8-77,5)
CD45R0+CD71+ Т-клетки (%)	5,5 (2,6-5,9) P<0,001	79,6 (73,7-85,9)	2,3 (1,8-3,8) P<0,001	61,2 (44,0-63,7)
CD45R0–CD71+ Т-клетки (MFI)	-191 (-237… -149) P<0,001	7827 (3626-10392)	96,3 (26,2-135,3) P<0,001	4456 (2922-5484)
CD45R0+CD71+ Т-клетки (MFI)	9,8 (-26,8…56,7) P<0,001	4436 (3152-4937)	220 (181-297) P<0,001	2184 (1497-3461)

Примечание. Указаны медианы и интерквартильные размахи. ФГА+ – клетки, стимулированные фитогемагглютинином; ФГА– – нестимулированные клетки. MFI – медиана интенсивности флуоресценции (median fluorescence intensity). Статистический анализ – U-критерий Манна-Уитни.

Взаимосвязь экспрессии Ki67 и CD71

Оценка взаимосвязи экспрессии Ki67 и CD71 показала наличие сильной положительной корреляции, которая наблюдалась в следующих субпопуляциях: CD4+ Т-клетки, наивные CD4+ Т-лимфоциты, CD4+ Т-клетки памяти, CD8+ Т-лимфоциты, CD8+CD45R0- Т-клетки, CD8+ Т-лимфоциты памяти (табл. 3).

Примечательно, что среди Т-лимфоцитов все Ki67-позитивные клетки экспрессировали CD71, но при этом в культуре присутствовала субпопуляция CD71-монопозитивных лимфоцитов (рис. 5).

Анализ численности CD71+Ki67– Т-лимфоцитов показал, что содержание этих клеток в стимулированных и нестимулирован-

Рис. 5. Показательная точечная диаграмма экспрессии CD71 и Ki67 в стимулированных Т-лимфоцитах [Indicative dot diagram of CD71 and Ki67 expression in stimulated T-lymphocytes]

ных образцах значительно превышало количество CD71+Ki67+ Т-лимфоцитов. Данное явление наблюдалась в их общем пуле (рис. 6А) и пулах CD4+ (рис. 6Б) и CD8+ (рис. 6В) Т-клеток.

Таблица 3

Связь между экспрессией CD71 и Ki67 в субпопуляциях T-лимфоцитов различной степени зрелости [The relationship between CD71 and Ki67 expression in subpopulations of T-lymphocytes of varying degrees of maturity]

Корреляционная связь	R	P
Т-клетки (%)	0,793	<0,001
CD4+ Т-клетки (%)	0,830	<0,001
Наивные CD4+ Т-клетки (%)	0,854	<0,001
CD4+ Т-клетки памяти (%)	0,823	<0,001
CD8+ Т-клетки (%)	0,847	<0,001
CD8+CD45R0- Т-клетки (%)	0,842	<0,001
CD8+ Т-клетки памяти (%)	0,827	<0,001

Примечание. При проведении анализа использован метод ранговых корреляций Спирмена.

□ CD71+Ki67* клетки □ CD71+Ki67- клетки

Рис. 6 . Процентное содержание CD71⁺Ki67⁺ и CD71⁺Ki67^– клеток среди нестимулированных и стимулированных Т-лимфоцитов.

ФГА+ – клетки, стимулированные фитогемагглютинином; ФГА– – нестимулированные клетки. Различия между группами устанавливали с использованием U-критерия Манна-Уитни (*** – P < 0.001). А – все Т-лимфоциты; Б – CD4+ Т-лимфоциты; В – CD8+ Т-лимфоциты

[Percentage of CD71+Ki67+ and CD71+Ki67 cells among unstimulated and stimulated T-lymphocytes.

PHA+ - cells stimulated by phytohemagglutinin; PHA- – unstimulated cells. The differences between the groups were established using the Mann-Whitney U-test (***– P < 0.001). A – all T-lymphocytes; B - CD4+ T-lymphocytes;

C – CD8+ T-lymphocytes]

Сходное отличие долей CD71+Ki67+ и CD71+Ki67– клеток было установлено в субпопуляциях различной степени зрелости, в т.ч. наивных Т-лимфоцитах и Т-клетках памяти (табл. 4).

Таблица 4

Отличие относительного количества CD71+Ki67+ и CD71+Ki67– клеток среди нестимулированных и стимулированных Т-лимфоцитов различной степени зрелости

[The difference in the relative number of CD71+Ki67+ and CD71+Ki67‒ cells among unstimulated and stimulated T-lymphocytes of varying degrees of maturity]

Показатели	ФГА–		ФГА+
	CD71+Ki67+	CD71+Ki67–	CD71+Ki67+	CD71+Ki67–
Наивные CD4+ Т-клетки (%)	0,17 (0,11-0,44) P 1-2 <0,001	5,76 (3,71-8,15)	11,51 (4,77-16,57) P 3-4 <0,001	80,42 (74,14-84,04)
CD4+ Т-клетки памяти(%)	0,59 (0,39-1,01) P 1-2 <0,001	4,91 (2,04-9,12)	9,15 (5,14-13,40) P 3-4 <0,001	69,30 (65,25-73,42)
CD8+ СD45R0-Т-клетки (%)	0,21 (0,13-0,38) P 1-2 <0,001	5,07 (2,70-6,40)	15,30 (4,96-19,44) P 3-4 <0,001	51,33 (48,76-54,76)
CD8+ Т-клетки памяти (%)	0,23 (0,20-0,33) P 1-2 <0,001	2,10 (1,60-3,50)	10,47 (6,12-15,51) P 3-4 <0,001	44,98 (34,25-53,42)

Примечание. Указаны медианы и интерквартильные размахи. ФГА+ – клетки, стимулированные фитогемагглютинином; ФГА– – нестимулированные клетки. Статистический анализ – U-критерий Манна-Уитни.

Известно, что функция рецептора трансферрина 1 состоит в поставке железа внутрь клетки [Gammella et al., 2017]. Активированным Т-лимфоцитам требуется больше этого микроэлемента, чем покоящимся клеткам. Так, железо необходимо для интенсификации биохимических процессов, связанных с последующим делением, в т.ч. активации циклин-зависимых киназ, синтеза дезоксирибонуклеотидов [Testa, Pelosi, Peschle, 1993] и железосерных кластеров митохондрий [Napier, Ponka, Richardson, 2005]. Также известно, что истощение запасов железа вызывает остановку клеточного цикла в G1/S и апоптоз лимфоцитов [Yu, Kovacevic, Richardson, 2007]. Однако наши данные свидетельствуют, что CD71-позитивные Т-клетки отражают субпопуляцию не только делящихся, но и активированных лимфоцитов.

Отсутствие экспрессии Ki67 в части CD71-позивтивных Т-клеток вызывает много вопросов. Поступившие внутрь лимфоцита атомы железа могут не только вовлекаться в процесс деления клетки, но и связываться с белком ферритином для хранения [Dörner et al., 1980]. Однако известно, что экспрессия рецептора трансферрина 1 и ферритина являются взаимоисключающими процессами в Т-лимфоцитах. Трансляция этих белков регулируется системой, включающей железочувствительный элемент мРНК (IRE) и его регуляторный белок (IRP) [Testa et al., 1991]. При активации Т-лимфоцита свободный от железа IRP присоединяется к мРНК рецептора трансферрина и усиливает трансляцию CD71, чем увеличивает поток железа в клетку. В это же время к мРНК ферритина присоединяется блокирующий его трансляцию IRP. Следовательно, усиление притока железа через обильно экспрессирующийся на активированных Т-лимфоцитах рецептор CD71 не может рассматриваться как механизм увеличения запасов микроэлемента, но свидетельствует о подготовке клеток к делению. Поэтому судьба CD71+Ki67– Т-лимфоцитов остается не до конца понятной.

Заключение

Таким образом, в стимулированной ФГА культуре мононуклеарных лейкоцитов по сравнению с не-стимулированными клетками растут доли Ki67+ и CD71+ Т-лимфоцитов, а также уровни экспрессии данных маркеров, что говорит о вступлении клеток в пролиферативный цикл. Ввиду того, что молекула CD71 экспрессируется как на делящихся, так и на активированных Т-лимфоцитах, этот маркер не является полным аналогом Ki67 и не может использоваться как точный индикатор пролиферации Т-клеток. Вместе с тем молекула CD71 может применяться при исследовании активации/пролиферации Т-лимфоцитов.