Новые возможности вольтамперометрического определения фармацевтических препаратов на органо-модифицированных электродах

В последнее время наблюдается повышение значимости использования современных унифицированных методов анализа как на предприятиях-производителях, так и в системе государственного контроля качества лекарственных средств в связи с увеличением их ассортимента на рынке. Проблемой, которая требует разработки новых, более чувствительных и селективных методов анализа, остается проблема фальсификации лекарственных препаратов. Фальсифицированное лекарственное средство – лекарственное средство, сопровождаемое ложной информацией о составе и (или) производителе лекарственного средства. В связи с чем необходим эффективный контроль за качеством выпускаемых препаратов, в состав которых входят витамины и флавоноиды. Это в свою очередь предъявляет повышенные требования к контролю за качеством лекарственных средств и совершенствованию методов количественного определения витаминов и флавоноидов в лекарственных препаратах и субстанциях

Базовым методом анализа качества субстанций и готовых лекарственных средств является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Также широко используются оптические методы анализа для определения витаминов и флавоноидов, тем не менее они трудоемки, требуют больших затрат времени и дорогостоящих реактивов [1]. Наряду с этими методами широко используются электрохимические методы анализа, о чем говорит проведенный обзор методов определения лекарственных веществ за последние пять лет. Возрастающий интерес к данным методам анализа связан с рядом достоинств: широкий диапазон определяемых концентраций, экспрессность, простота аппаратурного оформления и относительно невысокая стоимость оборудования.

Одним из наиболее универсальных электрохимических методов контроля фармацевтических препаратов является вольтамперометрический метод анализа (ВА).

Целью исследования являются разработка новых ВА способов определения ряда витаминов и флавоноидов на модифицированных электродах и методики их определения в фармацевтических препаратах и растительном сырье.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Растворы фоновых электролитов – 0,1М раствор КС1, подкисленный 0,1М НС1 (для витамина С), 0,01М НС1 (для витамина В2), 0,1М Na2HPO4 (для витамина В1, кверцетина, рутина) – готовили растворением навески или разбавлением кислоты в бидис-тиллированной воде до нужной концентрации. Основные растворы витаминов готовили растворением навески сухого порошка витамина в бидистиллиро-ванной воде. Арилдиазоний тозилаты получали по методу [2].

Все электрохимические измерения проводили с использованием вольтамперометрического комплекса СТА (ТУ 4215-001-20694097-98) с трехэлектродной системой. В качестве подложки модифицированного индикаторного электрода использовали графит (ГЭ). Электродом сравнения и вспомогательным электродом служил насыщенный хлоридсеребряный электрод (нас.х.э). Все измерения проводились при комнатной температуре и отсутствии кислорода, который удаляли из раствора током азота с массовой долей кислорода не более 0,01% (ГОСТ 9293-74).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее авторами был предложен способ поверхностной модификации графитовых электродов арилдиазоний тозилатами ArN₂⁺OTs^- [в печати], которые обладают уникальной стабильностью, безопасностью в обращении и, в отличие от тетрафторборатов, широко используемых для поверхностной модификации, хорошо растворимы в воде и многих органических растворителях. В данной работе мы получили поверхностно модифицированные графитовые электроды путем выдерживании электрода в водных растворах диазониевых солей 4-RC₆H₄N₂⁺ TsO^- (R=COOH, NH₂, NO₂). Реакция протекает в течение 5-10 сек, и в результате на поверхности электрода формируются ковалентно связанные с углеродом органические слои, содержащие соответствующие функциональные группы 4-RC₆H₄ - . Процесс модификации можно представить следующей схемой:

С + 4-RC 6 H 4 N 2+ TsO^- ^ C-C 6 H 4 R + N 2 + TsOH, где С – поверхность графитового электрода.

В результате были получены модифицированные электроды, содержащие на поверхности три типа функциональных групп – ГЭ-СООН, ГЭ-NH2 и ГЭ-NO2. Кроме того, на основе ГЭ-СООН получен 21

Рис. 1а. Градуировочная зависимость витамина С на графитовом (1) и модифицированных графитовых электродах: 2 – МГЭ-NO2; 3 – МГЭ-NH2; 4 – МГЭ-СООН

Рис. 1б. Вольтамперограммы витамина С:

1 – фон 0,1М KCl; 2 – 2,0 мг/л витамина C на ГЭ;

3 – 2,0 мг/л витамина C на МГЭ-СООН

модифицированный электрод с ртутью МГЭ-СООН-Hg на который перед модифицированием предварительно электрохимически была нанесена ртуть.

Модифицированные электроды ГЭ-СООН, ГЭ-NH2 и ГЭ-NO2. были исследованы для ИВ-анализа витаминов С, В2, кверцетина и рутина, а электрод МГЭ-СООН-Hg – для анализа витамина B1.

Как оказалось, модифицированные электроды обладают более высокой чувствительностью сравнительно с исходным графитовым электродом в ИВ анализе витамина С. При этом аналитическая эффективность модификаторов возрастает в ряду ГЭ-NO2 < ГЭ-NH2 < ГЭ-СООН (рис. 1а и 1б).

Причины обнаруженного эффекта повышения чувствительности графитового электрода при модификации указанными органическими функциональными группами неизвестны и требуют дальнейшего специального изучения. Тем не менее, учитывая практическую важность проблемы, мы сочли необходимым провести предварительные эксперименты по выяснению механизмов обнаруженных эффектов. Так, для выяснения причин большей чувствительности –PhCOOH группы, закрепленной на поверхности, по сравнению с –PhNH2 и –PhNO2 группами нами были проведены расчеты энергии Гиббса для соответствующих электрохимических систем по следующему уравнению:

AG = -z xExF, где z – количество электронов, принимающих участие в процессе;

Е – ЭДС электрохимической системы, В;

F – постоянная Фарадея, 96500 Дж.

Были получены следующие значения:

AG -СООН = 58,48 кДж, AG -NH2 = 171,38 кДж, AG -NO2 = 465,902 кДж.

Приведенные данные показывают, что наиболее энергетически выгодным является электрохимический процесс с участием карбоксигруппы, а наименее – нитрогруппы, так как самопроизвольные процессы в химических системах всегда направлены в сторону уменьшения энергии Гиббса, что полностью согласуется с экспериментом на примере витамина С (рис. 1а и 1б).

Другой фактор повышения чувствительности может быть связан с тем, что приведенные выше функциональные группы обладают определенным химическим сродством к определяемым объектам, повышая их концентрацию в приэлектродном слое. Для ответа на этот вопрос мы провели моделирование межмолекулярных взаимодействий кверцетина с PhCOOH, PhNH2 PhNO2 с использованием квантово-химического метода DFT B3LYP/6-311G** в водной среде в рамках сольватационной модели Томази (PCM метод). При этом для карбоксильной группы была принята карбоксилатная структура PhCOO-, поскольку ИВ-анализ проводится при pH>7. Оказалось, что кверцетин может давать с карбоксилатной группой четыре типа межмолекулярных комплексов с энергиями взаимодействия от -23,3 до -99,16 кДж/моль. Структура наиболее сильного комплекса приведена на рисунке 2.

Причиной столь высокой прочности комплекса является образование хелатных структур за счет водородных связей с двумя орто-гидроксильными группами.

Межмолекулярные взаимодействия кверцетина с нитробензолом, как оказалось, существенно более слабые (AG = -50,9 кДж/моль).

Рис. 2. Строение межмолекулярного комплекса кверцетина и фенилбензоата (DFT B3LYP/6-311G** PCM) с энергией взаимодействия -99,16 кДж/моль

Таблица 1

Условия выполнения измерений методом ИВ на МГЭ-СООН

Наименование органических веществ	Фоновый электролит; потенциал электролиза, В	Диапазон потенциалов развертки, В	Режимы регистрации вольт-амперограмм
Витамин С	0,1М KCl, подкисленный 0,1 М HCl до рН 3 – 4; -0,3	От +0,45 до +0,98	Накопительный
Витамин В1	0,1 М Na2HPO4; -1,6	От -0,15 до -0,35	Дифференциальный
Витамин В2	0,01 М HCl; -0,6	От - 0,20 до 0,15	Накопительный
Кверцетин	0,1 М Na2HPO4; -0,3	От +0,45 до +0,55	Дифференциальный
Рутин	0,1 М Na2HPO4; -0,3	От +0,10 до +0,22	Дифференциальный

Рис. 3. Схема анализа фармпрепаратов на содержание витаминов и флавоноидов

Таким образом, положительное влияние модификатора на чувствительность электрода можно объяснить образованием комплекса «модификатор – исследуемое вещество» на поверхности электрода. Данный процесс может способствовать концентрированию исследуемого вещества в при-электродном пространстве, повышая тем самым аналитический сигнал.

На основе проведенных исследований нами были предложены условия вольтамперометрического определения витаминов С, В2, кверцетина и рутина на МГЭ-СООН и витамина В1 на МГЭ-СООН-Hg и разработан алгоритм пробоподготовки для вольтамперометрического определения этих веществ в фармпрепаратах.

Условия определения витаминов и флавоноидов с помощью электродов модифицированных тозилатными солями арилдиазония приведены в таблице 1.

На основе проведенных исследований нами предложены условия вольтамперометрического определения витаминов С, В1, В2, кверцетина и рутина на графитовых электродах, модифицированных солями арилдиазоний тозилатами, в биологически активных добавках и фармпрепаратах. На примере фармацевтических препаратов и БАД был разработан алгоритм методики количественного химического анализа витаминов С, В1, В2, кверцетина и рутина, схема которого представлена на рисунке 3.

Сущность пробоподготовки состоит в переводе проб фармпрепаратов и БАД в раствор путем растворения навесок с последующим фильтрованием. Использование такой схемы позволяет провести ВА анализ БАД в среднем от 30 минут до 2 часов.

Правильность результатов, получаемых по разработанной методике, была подтверждена независимым методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (табл. 2.) и методом «введено – найдено» (табл. 3.)

Таким образом, на основе проведенных исследований нами был предложен способ поверхностной модификации графитовых электродов тозилат-ными солями арилдиазония, позволяющий повысить чувствительность электродов, а также предложены усло-23

вия и разработана методика вольтамперометрического определения витаминов С, В1, В2, кверцетина и рутина на модифицированных электродах в биологически активных добавках и лекарственных препаратах.

Таблица 2

Результаты определения водорастворимых витаминов и флавоноидов в растительных экстрактах разными методами

Определяемые компоненты	Объекты анализа	Методы контроля
		ВЭЖХ	ИВ
Витамин С, мг%	Экстракт плодов калины	195,1±19,5	225,0±56,3
	Экстракт пихты	25,4±9,5	23,8±7,1
Витамин В 1 , мг%	Экстракт плодов калины	Менее 0,2	0,04±0,01
	Экстракт пихты	Менее 0,01	0,21±0,06
Рутин, мг%	Экстракт плодов калины	Менее 0,2	0,03±0,01
	Экстракт пихты	0,23±0,02	0,75±0,22
Кверцетин, мг%	Экстракт плодов калины	2,22±0,20	3,1 ±0,9

Таблица 3

Результаты вольтамперометрического определения водорастворимых витаминов и флавоноидов в БАДе «Формула женщины» методом «введено – найдено»

Содержание в пробах	Введено, мг/л	Найдено, мг/л	Погрешность, %
Витамин С (с = 25,50± 4,7мг/л)	10,0	22,67±3,17	14
Витамин В1 (с = 0,5±0,1 мг/л)	0,5	0,73±0,10	14
Витамин В2 (с = 0,4±0,08 мг/л)	0,5	0,82±0,13	16
Рутин (с = 0,5±0,1 мг/л)	0,5	0,89±0,13	15
Кверцетин (с = 2,5±0,5 мг/л)	5,0	7,78±1,09	14

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 09-03-00019