Новый антиген для новой диагностической реакции на лейкоз крупного рогатого скота

эффективных серологических и молекулярногенетических препаратов, способных выявить инфицированных животных даже на ранних стадиях инфекционного процесса, до настоящего времени не изучены и не востребованы практикой пептиды с М.м. ниже 24 кД, либо выше 51 кД. Не изучена их роль и значимость для диагностики лейкоза КРС. Возможно, что пептиды с М.м. выше 51 кД сорбируются на эритроцитах более стабильно и более интенсивно, и будут наиболее перспективными для диагностики лейкоза КРС в реакции взаимодействия (агглютинации) с эритроцитами крови больного животного.

Цель работы: получить новый комплексный антиген из белков надосадочной жидкости линии клеток СПЭВ, контаминированной онкор-навирусами типа С и D, и изучить возможность его использования для диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

Материалы и методы. В работе использовали линию клеток СПЭВ, контаминированную онкорнавирусами типа C и D, не имеющими антигенного родства с вирусом лейкоза КРС. Посевная концентрация клеток (ПКК) составляла 80-100 тыс./мл, а в качестве ростовой питательной среды (РПС) использовали среду 199 с 10% сыворотки крови (СК) КРС с добавлением пенициллина (100 ед./мл) и стрептомицина (100 мкг/мл). Культивирование осуществляли стационарным методом в пластиковых матрасах в течение 5-6 суток при температуре 36±0,5Cº в анаэробных условиях. Содержимое культуральных сосудов однократно замораживали при температуре (-20-30)оС и оттаивали при 37оС, затем осветляли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин. Из надосадка выделяли белковую фракцию в фосфатно-солевом буферном растворе. Концентрацию белка определяли методом Лоури на биохимическом анализаторе StatFax 3300. Для определения молекулярной массы полученного белка проводили жидкостную хроматографию высокого давления (ЖХВД), на жидкостном хроматографе «Стайер», с использованием спектрофотометрического детектора А214 (длина волны 214 нм).

В работе было использовано 120 голов КРС, в том числе 100 голов для отработки способа диагностики лейкоза, 20 голов (из них 10 интактных и 10 инфицированных вирусом лейкоза) – для сравнительной оценки эффективности разработанного способа диагностики с общепринятыми методами (РИД, ИФА, ПЦР). Забор крови КРС проводили по общепринятой методике в объеме 5 мл от одного животного в пробирки со стабилизатором – лимоннокислым натрием. Из цитратной крови готовили 0,25–0,5% взвесь эритроцитов на физиологическом растворе для постановки диагностических реакций. Статистическую обработку экспериментальных данных проводили по общепринятым методикам (Лакин, 1973). Расчёт результатов осуществляли с применением пакета прикладных программ Statistica 6.0 (for Windows), результаты считались достоверными при p≤0,05.

Полученные результаты и их обсуждение. Механизмы персистенции и накопления онковирусов в перевиваемых линиях клеток изучены недостаточно. Известно, что активные формы кислорода эффективно уничтожают вирусы и онкоклетки. В ходе исследования установлено, что при соотношении питательной среды и воздушной фазы 1:10 (аэробные условия) на седьмые сутки культивирования отмечаются явления дегенерации монослоя и закисления питательной среды. При соотношении жидкой и газовой фаз 5:2, монослой тест-культуры был компактным и многослойным, питательная среда оставалась нейтральной, в ядрах ТК отмечали увеличение количества ядрышек, что указывает на активизацию метаболических процессов.

Для отработки технологии выделения антигена исходную культуру клеток СПЭВ, контаминированную онкорнавирусами типа C и D, засевали на ростовую питательную среду в пластиковые матрасы и культивировали при 37оС в течение 3-4 суток до формирования монослоя. Затем ростовую среду сливали и добавляли раствор Версена с трипсином для максимального снятия клеток монослоя посредством встряхивания. Через 3-5 минут раствор сливали и добавляли снова ростовую питательную среду, при этом доводили количество клеток в 1 мл среды до 100-120 тысяч. Далее клетки СПЭВ, контаминированные онкор-навирусами типа C и D, культивировали в пробирках Флоренского при 37оС в течение 3-4 суток до формирования монослоя в анаэробных условиях, при соотношении жидкой и газовой фаз 5:2. После этого ростовую среду меняли на поддерживающую среду и снова помещали пробирки в термостат при 37оС. Через 16-18 часов отбирали пробирки, в которых произошло разрушение монослоя, однократно замораживали их и оттаивали. В результате получали взвесь из оттаявших разрушенных клеток СПЭВ, контаминированных онкорнавирусами типа C и D.

Для исключения артефактов по неспецифическому разрушению монослоя клеток и накопления большего объема взвеси для получения диагностического средства, полученную суспензию из оттаявших разрушенных клеток СПЭВ вносили в следующую партию пробирок с монослоем и поддерживающей средой, выращенных в аналогично условиях, из расчета 20% суспензии и 80% поддерживающей среды с монослоем. Процедуру повторяли несколько раз до появления 90% количества разрушенных клеток в одной партии пробирок.

Чистота антигена на этапе предварительной подготовки является чрезвычайно важным фактором, поскольку возможные примеси могут конкурировать за адгезивные участки эритроцитов, особенно в течение первых 2-х часов. Поэтому для очистки взвесь клеток с разрушенным монослоем замораживали и оттаивали 2-3 раза, центрифугировали в течение 30 минут со скоростью 3000 об/мин., отбирали надосадочную жидкость и выделяли из нее белковую фракцию. Для этого надосадочную жидкость осаждали солевым раствором сульфата аммония в количестве 60% от насыщения, центрифугировали при 4500 об/мин, в течение 20 мин, удаляли надосадок, а осадок вновь растворяли в минимальном объеме 0,01М фосфатно-солевого буферного раствора при ph 7,4. Для концентрации белка раствор диализовали при помощи диализной мембраны с диаметром пор 3500 Да в 0,01 М растворе фосфатно-солевого буфера при pH 7,4 в течение 24 часов. После чего определяли концентрацию белка методом Лоури. Во всех повторностях исследований концентрация белка была в пределах от 4,9 мг/мл до 5,2 мг/мл. Эту выделенную белковую фракцию использовали в дальнейших исследованиях качестве нового антигена.

Исследование белкового состава КЖ ТК клеток СПЭВ, контаминированной онкорнавиру-сами типа C и D методом ЖХВД, является одним из общепринятых методов для оценки структурных компонентов исследуемого материала и их количества. Указанный метод дает дополнительную информацию о присутствии в исследуемом материале балластных и специфических белков, и поэтому является качественным критерием оценки чистоты исследуемых препаратов. Метод является высоко-воспроизводимым и удобным для работы с небольшим количеством антигена.

Определение молекулярной массы анализируемого образца препарата КЖ розового цвета, проводили на жидкостном хроматографе «Стайер»; для разделения использовали колонку

BioSep-SEC-S 2000 5 мкм 145А, 300х7,8 мм. В качестве элюента применяли 0,01М фосфатносолевой буфер, скорость потока составляла 1 мл в минуту. В качестве стандартов использовали бычий сывороточный альбумин с молекулярной массой 64-70 кДа, лактоферрин с молекулярной массой 75-80 кДа и папаин с молекулярной массой 20 кДа. Результаты исследования белкового состава культуральной жидкости представлены в табл. 1. Установлено, что основные белки (пики 1 и 2) имели молекулярную массу от 75 до 82 кДа и составляли 93% от всей массы входящих в надосадочную жидкость белков (табл. 1).

Таким образом, нами была разработана технология выделения нового антигена для диагностики лейкоза КРС и усовершенствованы методы контроля его качества. При выделении и стандартизации антигена нами были определены оптимальные условия культивирования клеток СПЭВ и накопления целевого продукта – антигена из белковых компонентов культуры клеток СПЭВ, контаминированной онкорнавирусами типа C и D, при строгом соблюдении оптимальных условий анаэробного культивирования, которые положительно сказываются на пролиферативной активности и сохранности монослоя клеток.

Таблица 1. Белковый состав культуральной жидкости клеток СПЭВ, контаминированной онкорнавирусами типа С и D методом жидкостной хроматографии высокого давления

Время, мин	Высота, mAU	Площадь, mAU*сек	Отношение каждого пика к общей площади пиков, А, %	Молекулярная масса пиков
11,36	58,44	5029,95	93,18	75-82 кДа
16,04	- 0,03	- 0,02	0,00	15-20 кДа
21,44	4,38	367,99	6,82	10 кДа и менее

Общепринятыми критериями оценки качества диагностических тест-систем (ТС) являются высокая чувствительность, специфичность и воспроизводимость результатов контроля тестируемых показателей. Нами были проанализированы имеющиеся в литературе данные о средствах для диагностики лейкоза КРС и способах диагностики заболевания с использованием этих средств. С учетом основных недостатков имеющихся методов, а также факта принадлежности вируса лейкоза к онковирусам типа C, оценивали возможность и перспективность использования нового антигена, полученного при культивировании линии клеток СПЭВ, контаминированной онкорнавирусами типа C и D, для диагностики лейкоза крупного рогатого скота в реакции гемагглютинации.

При разработке способа диагностики учитывали тот факт, что не были известны способы диагностики лейкоза КРС, основанные на агглютинирующей способности взаимодействия двух компонентов: водорастворимого белкового компонента из клеточной линии СПЭВ, контаминированной онкорнавирусами C и D, (а не эритроцитарного диагностикума, как это общепринято в постановке реакции агглютинации) и определенной концентрации взвеси эритроцитов цитратной крови инфицированного ВЛКРС животного. При разработке варианта реакции гемагглютинации (РГА) для диагностики лейкоза КРС оценивали в сравнительном аспекте характер и специфичность реакции взаимодействия неот-мытых (НЭ) и 3-кратно отмытых эритроцитов (ОЭ), полученных от интактных и инфицированных животных с комплексным антигеном, выделенным из культуральной жидкости (КЖ) тест-культуры (ТК) клеток СПЭВ, контаминированных онкорнавирусами типа C и D.

Технология изготовления и методы контроля качества рабочих суспензий эритроцитов были нами усовершенствованы. При разработке ТС для диагностики лейкоза КРС были отобраны гомологичные эритроциты, которые наиболее активно и прочно агглютинируются вирусом ВЛКРС. Технология получения суспензии эритроцитов осуществлялась в соответствии с общепринятыми методами. В тоже время строгое соблюдение условий забора крови, получения плазмы, трехкратно отмытых (ОЭ) и неотмытых (НЭ) эритроцитов и соблюдение режимов центрифугирования и хранения обеспечили в итоге стандартность производства рабочих суспензий эритроцитов с заданной концентрацией.

Постановку реакции осуществляли на специальных планшетах с лунками. Ряды лунок заполняли 0,25-0,5% взвесями эритроцитов цитратной крови. Одни из рядов лунок с разными концентрациями взвесей эритроцитов цитратной крови заполняли физ.раствором в каждой лунке (контроль), а в другие ряды с теми же разными концентрациями взвесей добавляли полученный новый комплексный антиген в том же количестве, как и физ.раствор. При этом, соотношение антигена к взвеси (а также физ.раствора к взвеси) было 1: 4-6. Выдерживали планшеты при температуре 4-8оС в течение 12-15 часов, после чего производили учет реакции. За положительный результат реакции принимали наличие осадка в виде зонтика с неровными краями по всей поверхности лунки. За отрицательный результат реакции принимали наличие осадка в виде пуговки или точки на дне лунки. Специфичность РГА оценивали по результатам адгезии нового комплексного антигена на рецепторах эритроцитов мукополипротеидной природы и выпадению осадка на дно лунок пластиковой панели в виде зонтика с неровными краями.

Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что наиболее выраженная РГА была при использовании рабочей суспензии не-отмытых эритроцитов в 0,5% концентрации, полученных от инфицированного КРС, и выдерживании смеси в течение 12–15 часов при температуре 4-8ºС. В тоже время в аналогичных условиях результаты взаимодействия эритроцитов рабочих (0,12 и 0,25%) суспензий отмытых и неотмы-тых клеток с новым комплексным были отрицательными или слабо выраженными. Необходимо отметить, что проведение РГА с использованием антигена из «Диагностического набора» (СТО 00482900-0019-2006) не дает положительных результатов ни с ОЭ, ни с НЭ плазмы, полученных от инфицированных животных, что свидетельствует об антигенных различиях и специфичности нового комплексного антигена и антигена, производимого «Курской биофабрикой». Таким образом, полученные результаты РГА с неотмыты-ми и отрицательная реакция с отмытыми эритроцитами рабочих суспензий свидетельствуют о наличии на рецепторах клеточных элементов плазмы крови специфических белков, положительно реагирующих только с новым комплексным антигеном.

На следующем этапе работы оценивали результативность диагностики лейкоза КРС в зависимости от температурного режима проведения РГА. Показано, что положительный результат на инфицированность животного лейкозом КРС в РГА был получен только в одном случае – при использовании не отмытых эритроцитов (в концентрации 0,5%), изготовленных из крови инфицированной телки, и нового комплексного антигена, через 12-15ч выдерживания смеси при температуре 4-8ºС. В остальных случаях результаты диагностики лейкоза КРС в реакции РГА были отрицательными или слабо выраженными. Достоверность результатов в РГА была подтверждена положительными результатами контроля СК исследуемого животного в РИД (+) и антигена лейкоза КРС в ПЦР (+).

Концентрация взвеси эритроцитов цитратной крови (0,25-0,5%), соотношение вводимого средства к цитратной крови (1:4-6), а также температурный режим (4-8оС), при котором выдерживали смесь в течение 12-15 часов, были подобраны экспериментальным путем. Так, при концентрации ниже 0,25% и количестве средства для диагностики менее одной части реакция с цитратной кровью практически отсутствовала, а при концентрации выше 0,5% и количестве средства более одной части реакции были не выражены, трудно учитывались. Температурный режим, при котором происходило взаимодействие антигена с взвесями эритроцитов цитратной крови, подбирался также экспериментально. Было апробировано 3 режима: при комнатной температуре (22оС), при 37оС и 4-8оС. При комнатной температуре и при 37оС реакции были плохо выражены, трудно учитывались.

Дополнительно были проведены эксперименты, аналогично описанным, с отмытыми эритроцитами, приготовленными общепринятым методом из цитратной крови животных. Было исследовано также 50 проб. Положительных результатов при использовании отмытых эритроцитов получено не было. Все результаты были отрицательными и не совпадали с общеизвестными методами. Таким образом, доказана возможность и специфичность предложенной РГА для диагностики лейкоза КРС у индивидуального животного при строго регламентированных показателях качества исходных ингредиентов - НЭ плазмы в 0,5% концентрации, нового комплексного антигена (полученного из надосадочной жидкости ТК клеток СПЭВ, контаминированных онкорнавирусами типа C и D) и оптимальных условий проведения реакции при температуре 4 -8ºС в течение 12 – 15 часов.

Далее была произведена сравнительная оценка эффективности разработанного способа диагностики лейкоза крупного рогатого скота и тестов РИД, ИФА и ПЦР при диагностике лейкоза КРС. Исследования проводили в одном из неблагополучных хозяйств на коровах 3-х летнего возраста. В эксперименты были отобраны 10 коров, инфицированных вирусом лейкоза КРС, которые одновременно реагировали положительно в РИД, ИФА и ПЦР, и 10 голов животных, не реагирующих одновременно ни в одной из указанных реакций. Все исследования были выполнены в двукратной повторности с целью подтверждения совпадения результатов исследования и выявления возможных ошибок. Полученные результаты представлены в табл. 2. Показано, что разработанный метод диагностики лейкоза позволяет эффективно выявлять инфицированных животных, и совпадает с результатами всех общепринятых методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота, что доказывает его специфичность.

Таблица 2. Сравнительная оценка эффективности разработанного способа диагностики лейкоза крупного рогатого скота и тестов РИД, ИФА и ПЦР

Группы исследуемых жи вотных	Наименование реакции и характер реакции
	РИД	ИФА	ПЦР	заявляемый способ
группа 1 (10 голов)	+	+	+	+
группа 2 (10 голов)	-	-	-	-

Выводы: нами был получен новый комплексный антиген из белковых компонентов культуры клеток СПЭВ, контаминированной он-корнавирусами типа C и D, для диагностики лейкоза КРС. Учитывая известную роль онкогенных

вирусов в патологии человека и животных, представленные нами данные об оптимальных усло-   5.

виях культивирования и накопления белкового компонента в линии клеток СПЭВ, рекомендуются для стандартизации производства активных 6. диагностических антигенов, значимость и состав которых окончательно не определены, но они могут быть востребованы для разработки иммунобиологических препаратов.

Впервые разработан метод определения инфицированности животных вирусом лейкоза КРС по агглютинирующей способности эритро-   8.

цитов цитратной крови животных с выделенным комплексным антигеном из белковых компонентов культуры клеток СПЭВ, контаминированной ^9. онкорнавирусами типа C и D. Данный метод позволяет быстро и с минимальными затратами проводить диагностику лейкоза КРС при сохранении эффективности диагностических исследо-    10.

ваний. Приоритет и новизна научных разработок защищены патентом РФ № 2560684 «Средство 11. для диагностики лейкоза крупного рогатого скота и способ его применения». Подана заявка на выдачу евразийского патента на изобретение №201500615 от 07.07.2015 г. «Средство для диаг-     ^.

ностики лейкоза крупного рогатого скота и способ его применения».

Работа выполнена в рамках «Плана фундамен- _13. тальных и приоритетных прикладных исследований Рос-сельхозакадемии по научному обеспечению развития АПК Российской Федерации на 2011 - 2015 годы» при выполнении этапа НИР: «Разработать новые и усовершенствовать существующие средства и методы борьбы с массо-   _14.

выми инфекционными болезнями молодняка животных на основе изучения их этиологической структуры, факторов патогенности возбудителей, закономерностей формирования иммунитета». Результаты исследований были использованы при выполнении НИР «Мониторинг _15. эпизоотической ситуации по заболеванию лейкозом крупного рогатого скота и разработка научнообоснованной эффективной системы профилактических и оздоровительных мероприятий».