Новый бактериальный штамм-деструктор 2, 4, 5-трихлорфеноксиуксусной кислоты

И звестно, что представители рода Pseudomonas имеют широкое распространение в биосфере, включая почвенный покров и воду. Псевдомонады обладают удивительной жизнеспособностью, имеются указания на то, что бактерии рода Pseudomonas способны участвовать в конверсии синтетических соединений. Так в литературе описан ряд штаммов рода Pseudomonas , осуществляющих утилизацию бифенилов и их хлорированных производных [9]. Среди представителей рода Pseudomonas обнаружены штаммы, способные осуществлять деструкцию летучих органических соединений [2], ПАУ [5-7], ДДТ [1, 3, 8]. Вместе с тем, имеется мало данных об участии псевдомонад в деградации молекул пестицидов, и, в частности, 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты, обладающей высокотоксичными и канцерогенными свойствами. Отсутствие сведений об особенностях процессов конверсии галогенсодержащих ксенобиотиков ароматического ряда во многом ограничивает возможности использования псевдомонад в качестве действующих элементов технологий защиты окружающей среды.

Цель настоящей работы – выявить культурально-морфологические и физиолого-биохимические характеристики штамма-деструктора 2,4,5-Т рода Pseudomonas .

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Объектом исследования являлся природный изолят 34Т, выделенный из образца почвенных по-

пуляций микроорганизмов Северного промышленного узла г. Уфы.

Определение морфометрических характеристик клеток осуществляли с помощью электронной атомно- силовой микроскопии на сканирующем зондовом микроскопе Solver PRO-M фирмы NT-MDT (Россия).

Сканирование вели в контактном режиме по методу постоянной силы с использованием кантилеверов CSG01 фирмы NT-MDT c радиусом кривизны зонда 10 нм.

Фотографические изображения колоний были получены в режимах макросъемки в проходящем и отраженном свете.

Классификацию культуры проводили согласно принципам фенотипической дифференциации бактерий 9-го издания руководства «Определитель бактерий Берджи» (1997).

Секвенирование ПЦР-продуктов последовательности гена 16S рРНК производили на автоматическом секвенирующем устройстве Avant 3150 (Applied Biosystems, США) со стандартным набором реактивов в прямом и обратном направлениях согласно рекомендациям производителя.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение индивидуальных морфологических и морфометрических характеристик клеток, а также исследование структуры их популяции показало, что культура 34T была представлена клетками палочковидной формы (рис. 1 В и С).

На мясопептонном агаре культура образовывала блестящие, гладкие колонии белого цвета с неровным краем и слизистой консистенцией (рис. 1 А). На рисунке 1 (В и С) клетки штамма 34Т видны в скоплении. Размер клеток составляет 1,0-2,0 х 0,30,5 мкм. Из рис. 1В видно, что клетки обладают жгутиками. Окраска клеток по Граму отрицательная.

Для культуры был характерен аэробный рост. Оптимальный диапазон температуры варьировал от +22°С до +41°С. При +4°С, а также в интервале температур от +45°С до +50°С, рост практически отсутствовал. При рН 5,7 наблюдался умеренный рост, а оптимум значений рН для роста составлял 6,8-7,0.

Филогенетическое положение штамма определялось на основе анализа последовательности гена

16S pPHK. Согласно результатам сравнения, осуществленного в формате программы MEGA4, было сделано заключение о том, что штамм принадлежит к филогенетически гетерогенному роду Pseudomonas (рис. 2).

А                      В

Рис. 1. Вид отдельной колонии бактериальной культуры 34Т на поверхности агаризированной среды (МПА) (А); АСМ-изображения клеток штамма 34Т (фрейм 10.5×10.5 мкм) (В, С).

С

op । — Pseudomonas corrugata DSM 72281

• I—    Pseudomonas kilmiensis D5M 136^77

  ---- Pseudomonas tkivervalensis СЕВР 11261T

-------- ♦ 54/

- Ps. frederiksbergensis DSM J 30227

I---- Pseudomonas cor.gciaris DSM1 49397

J Pseudom jfius Iremae СЕВР 61 117

— Pseudomonas cniororaphis D^ 196037

юс--------- Pseudomonas c'nloromphis DSM 6598

ioo I Psetudomonas cedrina CFML 96 1957

। Pseudomonas cedrina DEM 149381

Pseudomonas mohni IpA-2T im

- Pseudomonas moorei DSM 1264?'.

0.C05

Рис. 2. Филогенетическое положение штамма 34Т согласно результатам сравнительного анализа последовательности гена 16S рРНК.

Прим. Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 5 нуклеотидным заменам на каждые 1000 нуклеотидов. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью "bootstrap" – анализа (значащими признаются величины показателя "bootstrap" более 50) .

Последовательность гена 16S рРНК штамма 34Т образовывала кластер с тремя представителями рода Pseudomonas. Уровень гомологии генов 16S рРНК штамма 34Т и близких ему видов составлял около 99%. Наиболее близкими типовыми видами являлись Pseudomonas thivervalensis CFBP 11261T (99,2%), Pseudomonas corrugata DSM 7228T (99%) и Pseudomonas kilonensis DSM 13647T (99%). Принимая во внимание то, что последовательности ге- на 16S рРНК этих штаммов имели гомологию равную или превышающую 99%, было сделано заключение о том, что точное видовое типирование оказывается затруднительным вследствие одинаково высокой взаимной гомологии последовательностей 16S рРНК штаммов Pseudomonas thivervalensis CFBP 11261T, Pseudomonas corrugata DSM 7228T и Pseudomonas kilonensis DSM 13647T. Согласно по- лученным данным изучаемый изолят был классифицирован как штамм Pseudomonas sp. 34Т.

Проведено исследование динамики накопления биомассы Pseudomonas sp. 34Т в условиях исполь- зования 2,4,5-Т в качестве единственного источника углерода и энергии в периодической культуре (рис. 3).