Новый подход к определению подлинности комбинированных вакцин для профилактики дифтерии, столбняка и коклюша

В настоящее время в России для профилактики дифтерии, столбняка и коклюша используются как отечественные (АДС-М, АКДС), так и зарубежные препараты (Инфанрикс, Пентаксим). Одним из главных показателей качества вакцин являются подлинность и специфическая активность. В нормативных документах на отечественные комбинированные вакцины показатели “Подлинность” и “Специфическая активность” трактуются однозначно и определяются по иммуногенной активности в тестах “in vivo”. В Европейской Фармакопее для контроля “Подлинности” вакцинных препаратов рекомендуется использовать тесты “in vitro” [4]. Для обеспечения качества выпускаемых отечественных вакцинных препаратов необходимо совершенствование их стандартизации и контроля на основе международных требований. В связи с этим разработка простых экспрессных методов контроля подлинности комбинированных вакцин является актуальной.

Одним из экспрессных и легко выполнимых в лабораторной практике методов является реакция коагглю-тинации (РКОА). Первые работы по РКОА были выполнены G. Kronvall в начале 70-х гг. До настоящего времени не ослабевает интерес к этому методу. По данным литературы, коагглютинационные препараты разработаны для идентификации большой группы микроорганизмов в том числе легионелл, кампилобактеров, хеликобакте-ров [2, 3].

Цель исследования: разработка тест-набора, включающего диагностикумы для выявления дифтерийного, столбнячного анатоксинов и коклюшных антигенов в реакции коагглютинации (РКОА), и оценка возможности его применения для контроля подлинности вакцин.

Материал и методы

При выполнении настоящей работы использовали стафилококковый реагент, содержащий белок А [1]. Для получения гипериммунных сывороток кроликов иммунизировали дифтерийным анатоксином (ОКДА), столбнячным анатоксином (ОКСА), коклюшной суспензией (КС). Определение специфической активности сывороток проводили в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с помощью эритроцитарных антигенных диагно-стикумов соответствующей специфичности, которые готовили глютаральдегидным методом.

Для выделения антител применяли антигенные сор- бенты на основе цианбромированной сефарозы и геля гидроксида алюминия. Полученные антительные препараты изучали методом гельхроматографии на сефадексе G-200. Экспериментальные серии диагностикумов на основе стафилококкового реагента, содержащего белок А, получали с использованием кроличьих аффиноочищен-ных антител соответствующей специфичности. Приготовленные диагностикумы применяли для оценки полноты сорбции и антигенной активности адсорбированных препаратов. В качестве контрольных образцов использовали очищенные концентрированные столбнячный и дифтерийный анатоксины, коклюшную суспензию, АКДС-вакцину, отконтролированную по показателю специфической активности в тесте “in vivo”. Реакцию коаг-глютинации (РКОА) выполняли на стекле. Приготовленные разведения исследуемого материала переносили на стекло по одной капле (10 мкл). Затем к этим разведениям добавляли соответствующий диагностикум в равном объеме и перемешивали, осторожно покачивая стекло в руках. Результаты РКОА учитывали в пределах 5–10 мин визуально по образованию агглютинатов. Каждое исследование сопровождалось постановкой контроля на специфичность реакции.

Содержание компонентов в вакцинах определяли в сравнении с контрольными образцами. Расчет содержания антигенов в препаратах проводили по следующей формуле: Y = X x Z, где: Y – содержание определяемого компонента; X – обратная величина последнего разведения исследуемого материала, в котором наблюдалась положительная реакция; Z – показатель чувствительности диагностикума.

Результаты и обсуждение

Для приготовления коагглютинационных диагности-кумов важным моментом является получение и подбор иммунных сывороток, активно взаимодействующих с белком А. Основное требование к таким сывороткам – высокая специфическая активность, обеспеченная преимущественно иммуноглобулином класса G. Известно, что высоким сродством к белку А обладают иммуноглобулины кроликов. В этой связи для получения гипериммунных сывороток были апробированы различные схемы иммунизации кроликов на модели дифтерийного очищенного анатоксина. Применяли цикловую иммунизацию с предварительным грундированием, а также использовали адъюванты (полный или неполный адъювант Фрейнда, гель гидроксида алюминия). Наши данные ох- ватывают наблюдения более чем на 100 животных. Испытаны различные схемы иммунизации (табл. 1).

Лучшие показатели продукции антител были у кроликов, иммунизированных по схемам 1 и 3, причем в ряде групп отмечалась положительная сероконверсия у 100% животных. При иммунизации по схеме 1 после второго цикла средняя геометрическая титра антител у 40% животных составляла 1:135353,26. При этом высокие титры оставались в течение длительного времени на стабильном уровне, что позволяло использовать этих животных в качестве продуцентов гипериммунных сывороток. Отдаленная реиммунизация, как правило, давала выраженный “бустер”-эффект, но дозы анатоксина при каждой инъекции необходимо было подбирать в зависимости от индивидуальной реактивности кроликов. Высокие титры были получены при иммунизации кроликов по схеме 3. Однако на последующих циклах при введении как малых, так и больших доз анатоксина титры антител у животных стабилизировать не удавалось. У этих животных отмечался и слабый “бустер”-эффект. После окончания иммунизации средняя геометрическая титра антител составляла 1:25600. Достоинство этой схемы заключалось в относительно быстром нарастании титров, хотя срок полезной эксплуатации животных этой группы был небольшим. В последующих опытах для получения противостолбнячных и противококлюшных сывороток, предназначенных для приготовления коагглютинационных диагностикумов, брали за основу схемы 1 и 3. С помощью иммуноферментного анализа было установлено, что выбранные схемы иммунизации обеспечивают получение гипериммунных сывороток с высоким титром специфических антител.

Последующий анализ сывороток проводили на основании оценки их истощения белком А и изучения класс-принадлежности антител при фракционировании на сефадексе G-200. При заключительном отборе сывороток использовали реакцию флокуляции. Высокоактивные сыворотки имели максимальные титры по флокуляции

Таблица 1

Схемы иммунизации кроликов

50–100 МЕ/мл, среднетитровые – 10–40 МЕ/мл. В сыворотках после реиммунизации титр антител класса IgG превышал титр IgM-антител в 8–16 раз, а их удельная активность была выше в среднем в 5 раз. Титры антител в гипериммунных кроличьих сыворотках снижались не менее чем в 32 раза уже после однократной адсорбции их стафилококковой суспензией. Десорбированные антитела при электрофорезе в полиакриламидном геле (ПААГ) были гомогенными и соответствовали иммуноглобулину класса G. Анализируя механизм РКОА, мы пришли к выводу, что рутинная методика получения коагглю-тинационных диагностикумов с использованием нативных сывороток не обеспечивает полного выявления высоких потенциальных возможностей этой реакции, чувствительность которой может приближаться к ИФА и РИА. В гипериммунной сыворотке антитела заданной специфичности составляют около 20% от общего количества иммуноглобулинов, соответственно и на поверхности клеток стафилококка они могут фиксироваться в эквивалентной дозе. Следовательно, информативность теста может быть повышена при создании стафилококкового реагента с узконаправленной специфичностью за счет иммобилизации на клетках иммуноглобулинов только одной (заданной) специфичности. Практически это было возможно осуществить путем сенсибилизации стафилококка не нативной сывороткой, а очищенными антителами.

В этой связи нами были выполнены эксперименты по выделению высокоочищенных специфических иммуноглобулинов с помощью иммуносорбции из противодифтерийной, противостолбнячной и противоколюшной кроличьих сывороток. В работе были испытаны два вида иммуносорбентов: на основе геля гидроксида алюминия и на основе цианбромированной сефарозы 4В. В сравнительных экспериментах иммуносорбент на основе геля гидроксида алюминия, на котором антиген фиксирован за счет сорбционных связей, оказался менее пригодным для выделения антител, особенно из относительно низ-

№ п/п	Схема иммунизации	Результаты титрования сывороток (РНГА)*
1	Адъювант: гель гидроксида алюминия Грундирование: 30 ЛФ – 100 ЛФ анатоксина в/м. I цикл иммунизации (через 3–4 недели): до 6 инъекций	135353,26
	(подкожно) нарастающих доз анатоксина (10, 20, 30, 40, 50, 60 ЛФ), с интервалом в З–5 дней. II–IV цикл иммунизации (через 2 недели): по 2–4 инъекции (подкожно) в дозах анатоксина 20–50 ЛФ.	[104631,52–175095,48]
2	Адъювант: Полный адъювант Фрейнда (ПАФ). I иммунизация: 3 инъекции (1–2 в /м, 3 – в/бр) в дозе анатоксина 75 ЛФ.	9050,97
	II иммунизация (через 3–4 недели): 1 инъекция (в/м) в дозе анатоксина 150 ЛФ.	[6971,91–11751,2]
3	I иммунизация: 2 инъекции (в/м) в дозе 40 ЛФ анатоксина с ПАФ и гелем гидроксида алюминия. II иммунизация (через 4 недели): 2 инъекции (в/м) в дозе анатоксина 400 ЛФ с гелем гидроксида	25600
	алюминия.	[15186,7–43153,5]
4	Адъювант: ПАФ
	Грундирование: ПАФ в подушечку лапки. I иммунизация (через 2–3 недели): 3 инъекций одновременно (в/м, в/бр., в подушечку лапки)	12800
	в дозе анатоксина 50 ЛФ с ПАФ. II иммунизация (через 3 недели): 1 инъекция (в/м) в дозе анатоксина 80 ЛФ с ПАФ; 2 инъекция 20 ЛФ анатоксина (в/в).	[8541,81–19180,9]

Примечание: * – величина, обратная разведению сыворотки.

котитровых сывороток. В дальнейших опытах использовался иммуносорбент на основе цианбромированной сефарозы. Проведенными экспериментами была обоснована оптимальная схема иммуноаффинного выделения антител из противодифтерийных кроличьих сывороток. Далее она была распространена (с некоторыми коррективами) и на получение чистых антител из противостолбнячных и противококлюшных кроличьих сывороток. Анализ с помощью гельхроматографии на супердексе G-200 подтвердил высокую степень очистки и монофракционность выделенных антител.

В дальнейших исследованиях была проведена отработка условий приготовления специфических коагглю-тинационных препаратов, а также их оценка и стандартизация. При получении активного специфического ди-агностикума на основе дифтерийных, столбнячных, коклюшных антител было установлено, что в зависимости от удельной активности их оптимальная концентрация составляла 0,5–1,2 мг по белку на 1 мл 10% суспензии. Важно отметить, что установленные оптимальные концентрации антител обеспечивали достаточно полное насыщение рецепторного аппарата клеток стафилококка при однократном истощении раствора антител, бла- годаря чему ограничивались потери высокоочищенного антитоксина при получении диагносттикумов – специфически направленных стафилококковых реагентов. Полученные диагностикумы обладали гомогенностью и не давали спонтанной агглютинации. При взаимодействии с гомологичными антигенами в реакции коагглю-тинации наблюдалось быстрое формирование агглюти-натов. Для контроля специфичности диагностикумов использовали контрольные положительные образцы дифтерийного и столбнячного анатоксинов (несорбирован-ных) в рабочем разведении 1 Lf/мл и 1 ЕС/мл, коклюшную суспензию в концентрации 30 МОЕ. Диагностикумы выявляли искомые антигены и не давали перекрестных реакций с гетерологичными антигенами, что свидетельствовало о специфичности метода. При определении чув- ствительности РКОА показано, что минимально выявляемая концентрация для дифтерийного анатоксина составляла 0,052 Lf/мл, для столбнячного анатоксина – 0,052 ЕС/мл, коклюшного компонента – 0,32 МОЕ.

На следующем этапе работы в реакции коагглютинации с разработанными диаг-ностикумами нами были исследованы моно- и комбинированные препараты по показателю полноты сорбции. Чувствительность РКОА гарантировала выявление не-адсорбированных анатоксинов, содержание которых по нормативной документации (ФСП) должно быть для дифтерийного – не более 1 Lf и для столбнячного – не более 0,1 ЕС в 1 мл надосадочной жидкости. С помощью РКОА была подтверждена полнота сорбции антигенов непосредственно в процессе производства при получении 40 серий сорбированных вакцин (АКДС-Геп В, АДС-Геп В, АДС-М, АС, АД-М). Данная реакция оказалась достаточно информативным методом при оценке полно- ты сорбции антигенов на геле гидроксида алюминия. Мы имеем основание утверждать, что в этом случае ни один другой метод не может дать такой всесторонней количественной и качественной информации так же быстро, четко и оперативно, как РКОА.

Далее мы показали возможность использования РКОА для анализа готовых адсорбированных препаратов по показателю подлинности. В эксперименте были исследованы как отечественные вакцинные препараты, так и зарубежные (Инфанрикс, Пентаксим), а также экспериментальные серии, разрабатываемого нами комбинированного препарата с бесклеточным коклюшным компонентом (АаКДС). Всего изучено более 50 серий адсорбированных препаратов. В этих опытах в качестве контроля ставили реакцию с суспензией несенсибилизирован-ного стафилококка. Реакция была отрицательной, т.е. не отмечалось неспецифических взаимодействий за счет самого стафилококка и геля гидроксида алюминия. Использование РКОА как полуколичественного метода для анализа комбинированных вакцин позволило ориентировочно определять активность компонентов в составе препаратов. При определении подлинности адсорбированной вакцины достаточно выбрать ее рабочее разве- дение, дающее четко выраженную положительную реак- цию с гомологичным диагностикумом. Достоверность результатов РКОА должна подтверждаться отрицательными контролями: на специфичность (диагностикум с гетерологичным адсорбированным препаратом) и спонтанную агглютинацию (диагностикум с фосфатным буферным раствором). По результатам оценки адсорбированных препаратов в РКОА было показано, что антигенная активность дифтерийного, столбнячного и коклюшных компонентов в исследованных комбинированных препаратах (АКДС, АКДС-геп В) была равнозначной вакцинам Инфанрикс, Пентаксим и АаКДС. Отличия по активности препаратов АД-М и АКДС, АКДС-ГепВ; АС и

АДС-М, выявленные в РКОА, соответствовали различному содержанию компонентов в изученных препаратах

(табл. 2).

Реакция коагглютинации оказалась весьма удобной для проверки полноты сорбции и подлинности сорбированных препаратов. С одной стороны, – это экстрен-

Таблица 2

Оценка комбинированных вакцин по показателю “Подлинность” в реакции коагглютинации

Наименование препарата	Кол-во серий	Дифтерийный компонент, Lf/мл	Столбнячный компонент, ЕС/мл	Коклюшный компонент, УЕ/мл**
АДС-М	11	9,67±0,15	9,63±0,12	-
АКДС	15	29,97±0,33	9,68±0,16	19,73±0,39
АКДС-ГепВ	11	29,93±0,38	9,67±0,15	19,78±0,37
АД-М	5	9,68±0,17	-	-
АС	5	-	19,52±0,44	-
КС	10	-	-	59,53±0,66
АаКДС*	10	29,99±0,49	9,63±0,09	19,84±0,32
Инфанрикс*	5	29,77±0,55	9,68±0,15	19,64±0,49
Пентаксим*	5	29,80±0,56	9,83±0,21	19,52±0,44

Примечание: * – вакцины с бесклеточным коклюшным компонентом; ** – условные коагглюти-национные единицы.

ная, практически моментальная регистрация полноты сорбции (или возможности десорбции) анатоксинов – одного из важнейших критериев качества моно- и комбинированных препаратов. Здесь РКОА может стать основным методом контроля, исключив трудоемкий и инертный в данном случае биологический тест. С другой стороны, нами впервые показана возможность оценки антигенной активности непосредственно сорбированного препарата. По-видимому, эта уникальная возможность РКОА обеспечивается тем, что иммобилизат антител на стафилококке по своим размерным характеристикам хорошо может сочетаться в “иммунологической сети” с иммобилизатом антигена на геле гидроксида алюминия.

Таким образом, результаты проведенных исследований показали перспективность использования РКОА для контроля адсорбированых вакцин по показателю полноты сорбции и подлинности. Особо следует подчеркнуть возможность применения этой реакции для контроля вакцин без предварительной десорбции компонентов, что в значительной степени сокращает сроки проведения анализа. В то же время для оценки подлинности комбинированных вакцин методы, рекомендованные Европейской Фармакопеей, предусматривают предварительную десорбцию компонентов [4, 5]. При этом следует отметить, что последующие после десорбции преципитационные методы (радиальная иммунодифузия, встречный иммуноэлектрофорез, двойная иммунодиффузия), используемые для оценки подлинности, требуют значительного времени как на подготовительные работы, так и на осуществление самого анализа (табл. 3).

Заключение

В заключение следует отметить, что реакция коагглю-тинации информативна, легко выполнима и может быть рекомендована для включения в нормативно-техническую документацию на вакцинные препараты, что позволит гармонизировать методы контроля по показателю

Таблица 3

Продолжительность методов анализа для оценки подлинности адсорбированных вакцинных препаратов

Тесты, используемые для оценки подлинности	Продолжительность анализа с учетом десорбции компонентов вакцин
Биопроба (ФСП, Россия)	28–37 дней
Преципитационные методы (Европейская Фармакопея)	36–48 ч
Предлагаемая реакция коагглюти-нации	5–10 мин

“Подлинность” с требованиями Европейской Фармакопеи. Кроме того, разработанный тест-набор может быть использован для контроля подлинности зарубежных адсорбированных вакцин, поступающих на отечественный рынок.