О факторах, влияющих на токсичность протравителей семян для симбиотических азотфиксаторов в составе биопрепаратов

Бобовые культуры — это главный источник растительного белка (1). Средняя урожайность бобовых в России сильно уступает (иногда в разы) аналогичному показателю в странах Европы и в США (2, 3). Одна из существенных причин — малая эффективность технологий, применяемых в большинстве случаев. Парадоксальность ситуации в том, что именно в суровых климатических условиях, которые характерны для большей части российских сельскохозяйственных угодий (Урал, Сибирь), необходимость в самых современных агротехнических приемах многократно возрастает (4, 5). К ним, в частности, относится использование препаратов симбиотических клубеньковых бактерий, которые, заселяя корневую систему растения, обеспечивают ему способность фиксировать атмосферный азот (6-8). На российском рынке они представлены, но пока не получили широкого распространения. В числе прочих причин — отсутствие обоснованных регла- ментов применения микробиологических препаратов совместно с химическими средствами защиты растений. На практике это неизбежно снижает эффективность и рентабельности биопрепаратов, ведет к прямым экономическим потерям и необоснованно дискредитирует метод, который признается одним из важных элементов биологизации, экологизации и повышения устойчивости современного сельскохозяйственного производства.

В состав протравителей входят токсичные для микроорганизмов вещества, поэтому бактерии, на основе которых готовят микробиологические препараты, попадают в неблагоприятные условия. К сожалению, изучение совместимости биопрепаратов и протравителей явно отстает от появления новых потенциально пригодных для практики штаммов, форм биопрепаратов (9, 10) и изменений в технологии производства протравителей под одной и той же маркой (11, 12). Протравители (гербициды, фунгициды, инсектициды и т.д.) уже давно показали эффективность, технологии их применения отработаны (13, 14) и закрепились в отечественном сельском хозяйстве. Поэтому, если существуют сомнения в результативности совместного применения биологических и химических препаратов, на практике предпочтение отдается последним (15, 16). Иными словами, дефицит научных работ по оценке совместимости микробиологических и химических методов обработки семян зернобобовых (17, 18) может стать причиной отказа от биопрепаратов, несмотря на их экологичность (19, 20), экономичность (21) и эффект (22, 23) при повышения урожайности зернобобовых. Следует отметить, что отечественные публикации по этой проблеме крайне немногочисленны (24, 25).

В настоящем исследовании впервые представлены реузльтаты, подтверждающие, что на совместимость инокулянтов и протравителей на основе одного и того же действующего вещества существенно влияет метод производства протравителя, то есть качественный и количественный состав (формуляция) дополнительных компонентов (полимеры-пленкообра-зователи, адъюванты, поверхностно-активные вещества и т.д., которые, по мнению производителей, повещают технологичность протравителя), а также температурный режим бакового раствора. Эти данные дополняют те ограниченные сведения, которые касаются совместимости препаратов клубеньковых бактерий и химических средств защиты бобовых.

Нашей целью было определение влияния марки протравителя, его концентрации в растворе, времени выдержки раствора и температурного режима на количество выживших в растворе клубеньковых бактерий сои, люпина, гороха и чечевицы.

Методика . Штаммы клубеньковых бактерий сои ( Bradyrhizobium ja-ponicum 634б), люпина ( Bradyrhizobium lupini 367а), гороха ( Rhizobium legu-minosarum 261б) и чечевицы ( Rhizobium leguminosarum 712) были получены из ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Всероссийского НИИ сельскохозяйственной микробиологии (ВНИИСХМ, г. Санкт-Петербург). Препараты готовили на полусинтетической среде (0,5 г/л K₂HPO₄, 0,2 г/л MgSO₄•7H₂O, 0,1 г/л NaCl, 1,0 г/л дрожжевого экстракта, 10,0 г/л маннита) с последующим культивированием (28 °С, 170 об/мин, орбитальный шейкер-инкубатор ES-20/60, «BioSan», Латвия).

Были использованы следующие химические фунгициды: Maxim, КС (д.в. флудиоксонил, 25 г/л; «Syngenta International AG», Швейцария), Протект, КС (д.в. флудиоксонил, 25 г/л; ООО «Агро Эксперт Груп», Россия, «Agro Expert Group Kft.», Венгрия), Протект Форте, ВСК (д.в. флуди-оксонил, 40 г/л + флутриафол, 30 г/л; ООО «Агро Эксперт Груп», Россия, 1038

«Agro Expert Group Kft.», Венгрия).

Фунгициды и клубеньковые бактерии смешивали (20 % раствор бактериальной суспензии с 10 % и 20 % растворами протравителя каждой исследуемой марки). Через определенные интервалы (0, 1, 2, 4 и 8 ч) титры бактерий определяли высевом на чашки Петри с полусинтетической средой (состав указан выше) с добавлением 20 г/л агар-агара. Смеси куль- тур и фунгицидов выдерживали в холодильной камере (2-5 °C), при комнатной температуре в условиях лаборатории (16-18 °C) и в термостате

(27,5 °C). Через 10 сут (время роста клубеньковых бактерий на чашках Пет- ри) подсчитывали образовавшиеся колонии (КОЕ).

Рис. 1. Доля выживших ризобий Bradyrhizobium japonicum 634б (I) , Bradyrhizobium lupini 367а (II) , Rhizobium legumi-nosarum 261б (III) и Rhizobium leguminosarum 712 (IV) в смеси с 10 % (а) и 20 % (б) растворами фунгицидов Maxim (1) , Протект (2) и Протект Форте (3) (смесь культур и фунгицидов выдерживалась 8 ч при 16-18 ° C).

Статистическую обработку данных проводили с использованием программы Microsoft Excel 10. Для подтверждения достоверности различий между вариантами на рисунках и в таблице представлены средние значения ( M ) и стандартные ошибки средних (±SEM). Различия оценивали по t -критерию Стьюдента и считали статистически значимыми при р < 0,05. Повторность опыта 3-кратная.

штаммов микроорганизмов был обусловлен

Результаты. Выбор наибольшей практической значимостью культур (соя, люпин, горох, чечевица) в современной России и странах СНГ. В России на основе этих штаммов выпускают биопрепараты для бобовых под коммерческим наименованием Ризоторфин® (производитель ВНИИСХМ).

Смешивание химических протравителей с препаратами ризобий негативно влияло на выживаемость последних. Устойчивость клубеньковых бактерий разных зернобобовых культур к пестицидам была различной и уменьшалась в последовательности клубеньковые бактерии сои, люпина, гороха, чечевицы. Токсичность пестицидов увеличивалась в таком порядке: Maxim, Протект, Протект Форте (рис. 1).

Выживаемость ризобий в смеси с протравителями также в значительной степени зависела от температуры, при которой выдерживали смесь. Чем токсичнее для ризобий был протравитель (рис. 2), тем нагляднее про- являлось положительное влияние низких температур на выживаемость клубеньковых бактерий. Роль температурного фактора возрастала с увеличением концентрации протравителя. Так, доля выживших клубеньковых бактерий сои в смеси с 10 % раствором фунгицида Maxim спустя 8 ч после смешения при 2-5 и 16-18 °C составляла соответственно 72,02 и 68,88 %. В то же время для 20 % раствора фунгицида получили значения 65,73 и 31,12 %. Выявленная закономерность оказалась справедлива для каждой исследованной пары биопрепарат—протравитель.

В ряде случаев действующее вещество фунгицида не было главным фактором, определяющим динамику сокращения числа ризобий. Напри- мер, в состав самого малотоксичного для всех исследованных видов ризо-бий протравителя Maxim входит то же действующее вещество и в той же концентрации, что и в состав значительно более токсичного препарата

Рис. 2. Число колоний Bradyrhizobium japonicum 634б в растворе с 20 % фунгицидами Maxim (А) и Протект Форте (Б) в зависимости от времени выдержки и температурного режима смеси: 1 — комнатная температура (контроль), 2 — 2-5 ° C, 3 — 16-18 ° C, 4 — 27,5 ° C.

Протект (табл.). При этом токсичность фунгицида Про-тект для ризобий сои и люпина оказалась сопоставима с токсичностью препарата Про-тект Форте, несмотря на то, что у последнего концентрация флудиоксонила практически в 2 раза больше, а также присутствует второе действующее вещество — флут-риафол (см. табл.). Контролем служил 20 % рабочий раствор бактериальных суспензий в водопроводной воде; все различия между опытными и соответствующими контрольными вариантами статистически значимы при р < 0,05.

Доля выживших ризобий в смеси с 10 и 20 % растворами фунгицидов в зависимости от времени с момента смешения (смесь выдерживали при температуре 16-18 °C) (M±SEM)

Время, ч	Ризобии и концентрация фунгицида
	Bradyrhizobium			Rhizobium
	japonicum 634		lupini 367а	leguminosarum 261б		leguminosarum 712
	10 %	20 %	10 %     20 %	10 %	20 %	10 %	20 %
2	79,02±4,95	67,31±3,56	Maxim КС 82,56±5,64 73,76±4,26 83,43±5,23		81,6±5,26	81,67±5,27	63,33±3,21
4	75,52±4,20	65,91±3,24	75,36±4,58 69,92±3,98	74,11±4,13	67,2±3,89	71,67±7,13	60,00±3,14
8	68,88±3,98	31,12±1,72	64,48±3,67 47,36±2,58	70,19±3,98	34,7±1,94	41,67±2,10	23,33±0,79
2	75,20±4,45	50,30±3,12	Протект 60,69±3,33 33,49±1,49	КС 62,58±3,09	31,11±1,21	81,67±5,28	13,41±0,26
4	58,57±2,89	32,47±1,32	48,43±2,98 25,63±0,71	52,02±2,27	22,14±0,76	71,67±7,16	3,66±0,19
8	36,25±1,97	18,23±0,45	35,06±1,73 9,43±0,14	32,52±1,67	13,98±1,05	41,67±2,13	0,00
2	69,73±3,64	52,93±3,16	Протект Форте ВСК 55,03±3,57 38,76±2,03 39,00±1,99		17,00±0,54	2,62±0,16	0,00
4	46,12±2,31	27,73±0,86	46,64±2,75 18,12±0,41	36,00±1,75	14,00±0,34	1,07±0,12	0,00
8	28,68±0,95	22,03±0,69	22,65±0,74 3,69±0,10	22,00±0,68	1,00±0,12	0,12±0,10	0,00
П р и м еч а ни е. Все различия между опытными и соответствующими контрольными вариантами стати-
стически значимы при р < 0,05.

Анализ данных отечественной и зарубежной литературы по факторам токсичности протравителей для бактерий показал, что действующие вещества большинства протравителей (в чистом виде) определены исследователями, как в той или иной степени токсичные по отношению к ризосферным микроорганизмам (26, 27), в том числе к клубеньковым бактериям (28, 29). Сообщается (30), что контакт ризобий сои на инокулированных семенах с такими распространенными фунгицидными веществами, как каптан и тирам (контактные фунгициды), а также беномил, карбендазим, дифеноконазол и тебуконазол (системные фунгициды), вызывает значительное сокращение числа жизнеспособных бактерий. Не все дей- ствующие вещества протравителей однозначно токсичны по отношению ко всем видам и штаммам ризобий. Так, в работе M. Tariq с соавт. (31) ризобии гороха определены как устойчивые к бензимидазолам. По данным другого исследования (32), флудиоксонил оказывает значительное токсическое действие на ризобии сои. Авторы утверждают (32), что контакт ризобий сои с флудиоксонилом на инокулированных семенах значительно снижает число выживших бактерий по сравнению с контролем через 24 и 48 ч после инокуляции. Добавление к инокулянту полимера альгината значительно повышало выживаемость ризобий в контакте с флуди-оксонилом (32). Это позволяет предположить, что в нашем опыте лучшая выживаемость ризобий в смеси с протравителем Maxim по сравнению с протравителем Протект связана не с большей токсичностью дополнительных компонентов в составе последнего, а с защитным действием на ризо-бии полимеров в препарате Maxim. В пользу такого предположения говорит тот факт, что некоторые водорастворимые полимеры действительно повышают общую стойкость ризобий к неблагоприятным условиям среды, в частности добавление в бактериальную суспензию альгината натрия и кар-боксиметилцеллюлозы значительно увеличивает сроки хранения бактериального препарата (33). По-видимому, важен не только состав и концентрации действующих веществ протравителя, но и состав и концентрации дополнительных компонентов (полимеры-пленкообразователи, поверхностноактивные вещества — ПАВ, эмульгаторы, антисептики и т.д.), то есть так называемая формуляция препаративной формы протравителя. В ряде исследований подтверждается сильнейшее влияние полимеров-пленкообразовате-лей, адъювантов и ПАВ на выживаемость бактерий в биопрепаратах (34).

Есть сообщения, что разные марки протравителей (35) и различные температурные режимы при хранении баковых растворов заметно влияют на выживаемость бактерий в таких растворах. В ряде работ показана способность ризобий разлагать пестициды (36), что, впрочем, достаточно распространено среди ризосферных микроорганизмов (37). По имеющимся данным (38, 39), медленнорастущие ризобии сои Bradyrhizobium japonicum и быстрорастущие ризобии сои Sinorhizobium fredii могут расти на минеральнорастительной агаризованной среде с добавлением производственной концентрации фунгицида Maxim. При этом интенсивность их роста либо не уступает таковой в контроле (38), либо незначительно снижается (39).

Стоит отметить, что отсутствие явного токсического эффекта протравителя в отношении ризобий в совместном баковом растворе вовсе не гарантирует от негативных последствий для клубенькообразования (40, 41). В ряде работ описано ингибирующее действие фунгицида Maxim на интенсивность формирования клубеньков у инокулированых растений сои (24), при том что протравливание семян и их инокуляция были разделены во времени. В то же время некоторые авторы указывают (39), что инокуляция семян сои с протравливанием фунгицидом Maxim обеспечивает более интенсивное клубенькообразование, прирост надземной массы и достоверную прибавку урожайности по сравнению с инокуляцией «в чистом виде».

Таким образом, мы можем утверждать, что среди исследованных ризобий наиболее устойчивыми к протравителям оказались клубеньковые бактерии сои (Bradyrhizobium japonicum 634б), наименее устойчивыми — клубеньковые бактерии чечевицы (Rhizobium leguminosarum 712). В свою очередь, среди использованных протравителей самым малотоксичным для ризобий был фунгицид Maxim, самым токсичным — Протект Форте. Протравители Maxim и Протект, приготовленные на основе одного и того же действующего вещества с одинаковой его концентрацией, резко различа- лись по токсичности. Вероятно, токсичность этих фунгицидов для клубеньковых бактерий связана не только и не столько с действующими веществами в их составе, сколько с теми дополнительными компонентами (полимеры-пленкообразователи, поверхностно-активные вещества, эмульгаторы, антисептики и т.д.), которые производители добавляют в протравитель той или иной марки для улучшения ее технологических свойств (формуляция препаративной формы протравителя). Нахождение ризобий в одном растворе с протравителями негативно сказывается на выживаемости бактерий: чем дольше выдерживалась смесь, тем меньше оставалось жизнеспособных ризобий. С ростом температуры смеси и концентрации протравителей в растворе их токсичность увеличивается. Низкие температуры (2-5 °C) значительно повышают выживаемость ризобий.