О клеточной локализации и потенциальных партнерах взаимодействия нового белка гапонина

В 2007 году при исследовании фактора дифференцировки клеток линии промиелоцитарного лейкоза человека HL-60 (HLDF) были получены пептиды и заклонирована кДНК, принадлежащая гипотетическому белку человека [1]. Оказалось, что аминокислотная последовательность данного белка предсказана и в базе данных Национального центра биотехнологической информации США и называется EIF1AD (eukaryotic translation initiation factor 1A domain containing protein). Этот белок обладал структурной гомологией с трансляционным фактором EIF1A и, как большинство белков семейства S1, содержал PHK-связывающий домен. По данным [2] одним из вероятных партнеров взаимодействия EIF1AD в двугибридной системе является транскрипционный фактор STAT1 [3], который при проведении сигнала транслоцируется в ядро клетки [4].

Обнаруженный белок назвали гапонин (haponin, HLDF-alike protein). Длина его аминокислотной цепи 165 а.о. (рис. 1), расчётная молекулярная масса 19 , 2 кДа. Примечательно также, что аминокислотная последовательность гапони-на содержит неканонические сигналы ядерной локализации (рис. 1).

Целью данной работы является изучение распределения гапонина в клетке, а также определение партнеров взаимодействия белка.

Haponin 165aa

• 1    MSQATKRKHV VKEVLGEHIV PSDQQQIVRV LRTPGNNLHE VETAQGQRFL 51 VSMPSKYRKNIWIKRGDFLI VDPIEEGEKV KAEISFVLCK DHVRSLQKEG 101 FWPEAFSEVA EKHNNRNRQT QPELPAEPQL SGEESSSEDD SDLFVNTNRR 151 QYHESEEESE EEEAA

Рис. 1. Аминокислотная последовательность гапо-нина. Выделены потенциальные сигналы ядерной локализации

II.    Результаты и обсуждения

На первом этапе исследований была изучена экспрессия эндогенного гапонина в разных типах клеток млекопитающих. Для этого выделена тотальная PHK и приготовлены лизаты 6-ти клеточных линий человека: U87-MG (глиобластома), Hek293 (эмбриональные клетки почки), Panc1 (рак поджелудочной железы), Mcf7 (рак молочной железы), Nci–H460 (рак лёгких), K562 (миелоидный лейкоз) и клеток яичника китайского хомячка CHO-K1. Количество специфической PHK оценивалось методом ПЦР с обратной транскрипцией, а количество белка — вестерн-блоттингом с антителами к полноразмерному гапонину, экспрессированному в бакуловирусной системе. Результаты свидетельствуют о том, что эндогенный гапонин присутствует в большинстве эукариотических клеточных линий и его количество примерно одинаково (рис. 2). Также оказалось, что электрофоретическая подвижность природного белка соответствует молекулярной массе около 30 кДа, что указывает на наличие в исследуемом белке посттрансляционных модификаций.

Для исследования клеточной локализации га-понина на основе вектора pEGFP-C1 (Clontech, США), позволяющего экспрессировать GFP в эукариотических клетках, была создана рекомбинантная конструкция, кодирующая слитый белок GFP-Haponin, и проведена транзиентная трансфекция клеток линии CHO-K1. При этом обнаружено ядерное накопление белка GFP-Haponin, тогда как GFP не проявлял такого эффекта (рис. 3). Известно, что GFP благодаря своим небольшим размерам (27 кДа) может проникать сквозь ядер-ную пору и накапливаться в ядре [5], поэтому для клеток, трансфицированных пустым вектором, характерно диффузное окрашивание ядер.

Рис. 2. Экспрессия эндогенного гапонина в различных эукариотических линиях: U-87 MG, Hek293, CHO-K1, Panc 1, Mcf7, Nci–H460, K562: а — ПЦР с обратной транскрипцией на матрице кДНК клеточных линий с праймерами, синтезированными по нуклеотидной последовательности гапонина. Контроль — ген GAPDH; б — вестерн-блоттинг тотальных клеточных лизатов с антителами к полноразмерному гапонину, синтезированному в бакуловирусной системе

Рис. 3. Транзиентная трансфекция клеток CHO-K1: а, б — плазмидной конструкцией, экспрессирующей GFP-Haponin; в, г — вектором, экспрессирующим GFP; а, в — флуоресценция ( 488 / 507 ); б, г — светлое поле. Фотографии сделаны через 24 ч после трансфекции, микроскоп OlympusCX 41, InfinityX DeltaPix Camera

Рис. 4. ПЦР с обратной транскрипцией CHO-K1 и её стабильных клонов: а — ПЦР с праймерами, синтезированными по нуклеотидной последовательности гапонина, б — контроль (ген GAPDH)

Рис. 5. Вестерн-блоттинг ядерных и цитоплазматических лизатов клеток линии CHO-K1 и её стабильных клонов: а — гибридизация с моноклональными антителами к GFP, б — окрашивание мембраны Ponso–Red; 1--3 — ядерная фракция, 4--6 — цитоплазматическая фракция, 1, 6 — CHO-K1-GFP, 2, 5 — CHO-K1, 3, 4 — CHO-K1-GFP–Haponin

Рис. 6. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия (Nikon TE-2000, Japan) клеток исходной линии CHO-K1 (а, б) и её производных, стабильно экспрессирующих GFP-Haponin (в, г) и GFP (д, е); а, в, д — флуоресценция, 543 нм; б, г, е — окрашивание ядерного хроматина DAPI, 488 нм. Сигнал исходной линии

CHO-K1 в зеленом канале отсутствует

На основе линии CHO-K1 мы вывели стабильные клоны, экспрессирующие GFP-Haponin, а также клоны, экспрессирующие GFP. Появление PHK, кодирующей слитый белок GFP-Haponin, было подтверждено методом ПЦР с обратной транскрипцией на матрице тотальной PHK, выделенной из клеток линий CHO-K1, CHO-GFP и CHO-GFP-Haponin (рис. 4). В качестве эндогенного контроля использовали ген GAPDH. Усиление яркости полосы гапонина свидетельствует об увеличении количества PHK гапонина в клетках CHO-GFP-Haponin.

Экспрессия химерного белка также была подтверждена с помощью иммуноблоттинга ядерных и цитоплазматических фракций клеток выведенных клонов и исходной линии c моноклональными антителами к GFP (рис. 5). Экспрессируемый комплекс GFP-Haponin присутствует и в ядерной, и в цитоплазматической клеточных фракциях и имеет ожидаемый размер 55--60 кДа.

Для подтверждения ядерной зации гапонина в клетках мы окрашивание ядерного хроматина локали- провели DAPI

бильных клонов. В процессе проведения эксперимента были подобраны условия пермеабилизации с использованием мягкого детергента дигитонина, так как использование Тритон–X-100 приводило к вымыванию GFP из цитоплазмы клеток. Полученные фотографии флуоресцирующих клеток (рис. 6) анализировали с помощью программы ImageJ, позволяющей сравнить среднюю интенсивность флуоресценции в области ядра и цитоплазмы клетки. Для каждой культуры обсчитывали не менее 50 клеток. Полученные данные подтверждают ядерную локализацию GFP-Haponin (рис. 7) и, так как размер слитого белка превышает размер ядерной поры, указывают на наличие

(4 , 6-диамидино-2-фенилиндол) фиксированных

Рис. 7. Отношение среднего сигнала в области ядра клетки к среднему сигналу в области цитоплазмы.

Усреднение по 50 клеткам. Подсчёт выполнен в программе ImageJ

Рис. 8. Кривые пролиферации CHO-K1 и её стабильных производных: а — флуоресценция прикрепившихся клеток, б — измерение уровня АТФ с помощью люминисцентного тест-набора (Promega)

При культивировании CHO-K1, CHO-GFP и CHO-GFP-Haponin было замечено, что клетки, экспрессирующие GFP-Haponin, пролиферируют значительно медленнее других двух линий. Для сравнения скорости пролиферации клеток мы определяли количество живых клеток в культуре в разные временные точки двумя способами. Во-первых, для флуоресцирующих линий CHO-GFP-Haponin и CHO-GFP с помощью флуориметра измеряли флуоресценцию клеток, прикрепившихся ко дну плашки. Во-вторых, для всех трёх линий производили измерения количества АТФ в клеточных лизатах с помощью набора реагентов Cell Titer–Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega). Оба метода подтвердили, что скорости пролиферации клеток CHO-K1 и CHO-GFP практически совпадают, что говорит о том, что экспрессия GFP не оказывает существенного влияния на клетку, а клетки двух клонов, экспрессирующих GFP-Haponin, пролиферировали в 1.5 и 2 раза медленнее (рис. 8). Примечательно, что по литературным данным активация STAT1, вероятного партнера гапонина, может ингибировать пролиферацию [6].

В процессе исследования белка была получена экспрессия гапонина с полигистидиновым тагом на N -конце в бакуловирусной системе. Экспрессированный гапонин использовали для получения поликлональных антител на полноразмерный белок и для поиска белка-партнера гапонина методом соосаждения (pull-down). Для эксперимента использовали посаженный на Ni-NTA-сефарозу гапонин, выделенный из клеток насекомых, и тотальный лизат клеток CHO-K1. Связавшиеся с Ni-NTA-сефарозой и гапонин-содержащей смолой белковые фракции разделялись на ПААГ, и продукты специфического связывания направлялись на LC-MS. Было показано, что предполагаемыми партнерами гапонина являются глицеральде-гид-3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH) и фактор элонгации 2 (EF2) (рис. 9). Кроме того, белки актин и белок теплового шока 90 кДа (Hsp-90) были обнаружены как в специфической, так и неспецифической фракциях.

GAPDH в изобилии присутствует в клетке и играет важнейшую роль в энергетических процессах, но, с другой стороны, обладает широким набором функций, не связанных с гликолизом: регуляция трансляции, ядерный экспорт PHK, репликация и репарация ДНК, апоптоз [7--9]. Разнообразие функций, показанных для GAPDH, в особенности наличие у него ядерных функций, указывает на возможность взаимодействия с гапонином.

Основной функцией EF2 является катализ транслокационного перехода с участием ГТФ при трансляции белка на рибосоме [10]. Наличие у га-понина PHK-связывающего домена и его структурная гомология с EIF1A позволяют предположить участие белка в рибосомальном синтезе, что подразумевает взаимодействие с другими рибосомальными белками.

а               о

Рис. 9. Pull-down из тотальных лизатов клеток культур CHO-K1 с использованием гапонина, экспрессированного в бакуловирусной системе, посаженного на Ni-NTA-сефарозу: а — специфическое связывание, б — неспецифическое связывание; 1 — гапонин ( 30 кДа), 2 — GAPDH ( 37 кДа), 3 — актин ( 42 кДа), 4 — Hsp-90 ( 90 кДа), 5 — EF2 ( 95 кДа). Денатурирующий электрофорез в 13% -полиакриламидном геле

Таким образом, в данной работе было продолжено исследование недавно открытого белка га-понина [1]. Было показано, что эндогенный гапо-нин присутствует в разных типах эукариотических клеток. Стабильная экспрессия слитого белка GFP-Haponin в клетках CHO-K1 вызывает два эффекта: во-первых, наблюдается ядерное накопление продукта экспрессии. Во-вторых, экспрес- сия химерного белка вызывает замедление пролиферации клеток по сравнению с контрольными линиями CHO-K1 и CHO-GFP. Также были идентифицированы вероятные партнеры гапони-на — белки GAPDH и EF2, позволяющие предположить связь гапонина с рибосомой и процессом трансляции. Однако для подтверждения нашей гипотезы требуется проведение дальнейших экспериментов по иммунопреципитации гапонина антителами против GAPDH и EF2 и изучение его PHK-связывающей способности. Также остаётся открытым вопрос о взаимодействии гапонина со STAT1.

III.    Экспериментальная часть III.1.    Материалы

В работе использованы следующие реагенты: cреда сухая DMEM, пенициллин-стрепто-мицин, неомицин, раствор трипсин / ЭДТА (Sigma, США), эмбриональная бычья сыворотка (ПанЭко, Россия), трансфекционный агент Transfast, эндонуклеазы рестрикции BamHI, EcoRI, Sal1, Taq-полимераза (Promega, США), вектор pEGFP-C1 (Clontech, США), остальные реактивы — фирмы Sigma, США. Также использовали набор для выделения тотальной PHK «RNeasy mini Kit» (Quiagen, США), набор для выделения плазмидной ДНК и набор для люминесцентной детекции живых клеток «Cell Titer–Glo Luminescent Cell Viability Assay» (Promega, США).

Для экспрессии гапонина в бакуловирусной системе Bac-to-Bac (Invitrogen) применяли вектор pFastBacHT-B, клетки E. Coli DH10Bac, клетки насекомых SF9 (Invitrogen)

Для иммунохимических исследований использовали сыворотку кролика, содержащую поликлональные антитела на экспрессированный в бакуло-вирусной системе гапонин. Моноклональные мышиные антитела против GFP были любезно предоставлены к.б.н. Т. Ерохиной, ИБХ РАН. Также использовали козьи антитела к иммуноглобулинам кролика, овечьи антитела к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена (US BioLogical, USA).

• III.2.    Методы

ПЦР, электрофорез нуклеиновых кислот и белков, вестерн-блоттинг, трансформация бактериальных клеток, культивирование, транзиентная и стабильная трансфекция эукариотических клеток проводились, как описано, повсеместно.

• III.3.    Клонирование

Первоначально кДНК гапонина была заклони-рована в вектор pGem-T-Easy (Promega, США), затем по сайтам EcoR1 переклонирована в полилинкер экспрессирующего вектора pEGFP-C1

(Clontech, США). Клоны, содержащие кДНК га-понина в правильной ориентации, отбирали с помощью ПЦР, а сохранение рамки считывания при переходе от кДНК GFP к кДНК гапонина подтверждали определением нуклеотидной последовательности. Полученный конструкт pEGFP-Haponin далее использовали для изучения клеточной локализации гапонина.

• III.4.    Конфокальная микроскопия

  Подготовка клеточных препаратов для окрашивания DAPI проводилась по стандартной методике [11], в качестве пермеабилизующего агента использовали 0 , 2% дигитонин. После окрашивания регистрацию проводили на инвертированном микроскопе Nikon TE-2000 (Japan), снабженном конфокальной лазерной системой C1, лазерами Ar (488), G-NeHe (543), под объективом CF1 fluor 100x oil, violet corrected, фотографировали и анализировали распределение интенсивности в зеленом и синем каналах с помощью программы ImageJ и встроенных плагинов.

• III.5.    Анализ пролиферации

  Для сравнения уровней пролиферации клеточных линий клетки, достигшие 80% конфлю-ентности, рассеивали на 96-луночную плашку с затемненными стенками по 1000 клеток в лунку, по 2 ряда на клеточную линию и культивировали в CO 2 -инкубаторе при 37 ° C. Крайние ряды лунок заполняли средой. Для измерений использовали прибор Universal Microplate Analyzer Fusion–Alpha FP HT (Perkin Elmer, США) со встроенным люминометром и флуориметром. Ежедневно измеряли интенсивность флуоресценции клеток, прикрепившихся к пластику, а также, используя набор «Promega Cell Titer–Glo Luminescent Cell Viability Assay», определяли количество АТФ в клеточных лизатах по люминис-ценции. Ежедневно лизировали по 4 лунки, засеянные клетками каждой линии. Лунки со средой выступали в качестве контрольных. Результаты обрабатывались в программе MS Excel и представлялись в виде зависимости клеточного прироста от времени культивации.

• III.6.    Выделение гапонина из клеток насекомых. Pull-down

В бакуловирусной системе экспрессии «Bac-to-Bac» (Invitrogen, США) была получена экспрессия рекомбинантного гапонина, содержащего полигистидиновый таг на N -конце. Продукт экспрессии был очищен методом аффинной хроматографии на Ni ²⁺ -сефарозе и использовался для получения поликлональных антител на гапонин и для поиска белка-партнера методом pull-down.

Осадки (3--4 г) клеток насекомых SF9, содержащие экспрессированный гапо-нин, лизировали в буфере А (0 , 5 MNaCl,

20 мМ Tris -HClpH8 , 2 , 0 , 1% Triton -Х-100) с добавлением ДНКазы и ингибиторов протеаз. Детер-гент-растворимую фракцию лизатов инкубировали с 2 мл Ni ²⁺ -сефарозы при +4 ° C в течение часа. Связавшийся гапонин отмывали буфером А, содержащим 30 мМ имидазола, до полного исчезновения белка в отмывке, элюировали буфером (0 , 5 МNaCl, 20 мМ Tris -HClpH8 , 2, 0 , 5 М имидазол) и пропускали через гель-фильтрационную колонку для обессоливания. Полученный гапонин иммобилизовали на небольшое количество Ni ²⁺ -сефарозы (250 мкл) в течение ночи при +4 ° C и отмывали. Конфлюэнтные клетки CHO-K1 (50 млн) лизировали в буфере А, содержащим 0 , 5% T riton -X-100, ДНКазу, ингибиторы протеаз. К детергент-растворимой фракции лизата добавляли раствор 3% октилглюкозида в 20 мМ T ris -HCl, доводя концентрацию NaCl до 150 мМ. Подготовленный таким образом лизат инкубировали с Ni ²⁺ -сефарозой (1 мл) при +4 ° C в течение 40 мин. Затем фракцию, не связавшуюся со смолой, наносили на колонку с иммобилизованным гапонином. Колонку промывали отмывочным буфером (0 , 5% октилглюкозид, 150 мМNaCl, 20 мМ T ris -HCl, 0 , 3% T riton -X-100), затем элюировали гапонин в комплексе с возможными белками-партнерами буфером для элюции. Полученные фракции анализировались с помощью электрофореза в ПААГ. Гели окрашивались по методу Кумасси, и интересующие полосы вырезались и сдавались на жидкостную хроматомасс-спектро-мектрометрию.

IV.    Статистика проведения экспериментов

Эксперименты по определению уровня экспрессии гапонина в клеточных линиях, транзи-ентной трансфекции и соосаждению (pull-down) повторялись трижды с аналогичными результатами. По 2 стабильных клона, экспрессирующих GFP и GFP-Haponin, были получены и использованы для изучения локализации продукта экспрессии и скорости пролиферации клеток выведенных линий. Люциферазный и флуоресцентный анализ на пролиферацию и конфокальная микроскопия повторялись по 2 раза для каждого клона с аналогичными результатами. На фотографиях представлен типичный эксперимент, на гистограммах и графиках приведены средние значения для нескольких экспериментов и стандартные отклонения.

V.    Благодарности

Данная работа выполнялась при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 08-04-01127-а) и гранта Российской академии наук по молекулярной и клеточной биологии.