О конструировании геномов: новые возможности в селекции яблони (Malus domestica Borkh.) на устойчивость к парше, качество и технологичность

Целенаправленная крупномасштабная селекционная программа по выведению иммунных к парше сортов яблони осуществляется во Всероссийском НИИ селекции плодовых культур (ВНИИСПК) с 1977 года. За

Исследования выполняются за счет гранта РНФ (проект № 14-16-00127).

период с 1977 по 2014 год во ВНИИСПК по этому направлению проведена гибридизация в объеме 2,4 млн цветков, выполнено 2307 комбинаций скрещиваний, на искусственном фоне изучено 452,9 тыс. селекционных сеянцев, перенесено в селекционные сады 60,5 тыс. сеянцев (13, 14).

Триплоидные сорта яблони характеризуются меньшей периодичностью плодоношения по годам, более высокой массой и товарностью плодов, повышенной самоплодностью и устойчивостью к парше. Инициаторами селекции яблони на полиплоидном уровне были шведские ученые. Еще в конце 1930-х годов H. Nilsson-Ehle (15, 16) был вдохновлен идеей селекции триплоидных сортов при скрещивании широко распространенных диплоидных сортов с тетраплоидами. Отмечалось даже, что развитие этого направления следует считать вступлением в новую эру селекции яблони (17, 18). Однако в дальнейшем эти работы в Швеции не получили должного развития.

История происхождения колонновидных форм яблони такова. В 1964 году в Канаде, в селении Келовна (провинция Британская Колумбия) хозяин яблоневого сада на 50-летнем дереве сорта Мекинтош обнаружил необычную толстую ветвь, похожую на палку, так как она была почти без боковых ветвей и вся покрыта кольчатками и копьецами с большим числом яблок. По договоренности с хозяином эту необычную спонтанную мутацию размножили и назвали Важак (19). Эта природная мутация не обладала необходимой урожайностью и не получила широкого распространения как промышленный сорт, но стала исходной формой для селекции. Мекинтош «Важак» характеризуется слаборослостью, короткими междоузлиями, высокой облиственностью. Селекция колонновидных сортов в настоящее время ведется в Англии, России и во многих других странах (20, 21). Колонновидность яблони контролируется геном Со. Дальнейшее изучение биологии и хозяйственной ценности колонновидной яблони представляет большой интерес. Имеются сведения об использовании плодов колонновидной яблони для производства концентрированного сока (22).

Нами впервые в России поставлена задача разработать генетические основы селекции с учетом природно-климатических условий региона и усовершенствовать ранее существовавшие подходы для создания генотипов, объединяющих основные целевые признаки: иммунитет к парше (ген V f , колонновидность (ген Со ) и триплоидный набор хромосом.

Целью настоящей работы было получение и селекционная оценка отечественных иммунных, триплоидных и колонновидных сортов яблони для селекции форм, используемых в суперинтенсивных садах.

Методика. Использовались исходные формы яблони с идентифицированными генами устойчивости к парше ( V , V_r, V m ), колонновидности ( Со ), доноры диплоидных гамет (4х).

Основу исследований составляли программы и методики селекции и сортоиспытания, включающие рекомендации по статистической обработке данных (23, 24). В создании новых сортов широко использовался пребридинг (предварительная оценка исходных сортов и форм, использование лучших источников и доноров). Генетическое разнообразие образцов достигалось за счет гибридизации, в том числе отдаленной и повторной. Выбраковки проводили в теплице на искусственном инфекционном фоне и в школке.

При цитоэмбриологическом исследовании подготовку препаратов, окрашивание и просмотр выполняли по стандартным методикам (25) на микроскопе Nikon-50i («Nikon Co.», Япония).

Результаты. Совершенствование технологии выведения сортов яб- лони, разработка и использование методов интенсификации селекции в процессе исследований позволили сократить время на выделение сорта яблони с 30-35 лет до 20 и даже 18 лет.

Иммунитет к парше. Всероссийский НИИ селекции плодовых культур — пионер в создании иммунных к парше сортов яблони в России. В настоящее время создано в институте и включено в Государственный реестр селекционных достижений, допущенных к использованию, 22 иммунных к парше сорта. Лучшие 10 из них: летние Масловское (сорт Редфри х сорт Папировка тетраплоидная), Юбиляр (сеянец 814 — свободное опыление), сорт осеннего созревания Солнышко (814 — свободное опыление) и сорта с зимним созреванием плодов Афродита (814 — свободное опыление), Болотовское (сорт Скрыжапель х 1924), Веньями-новское (814 — свободное опыление), Имрус (сорт Антоновка обыкновенная х OR18T13), Кандиль орловский (1924 — свободное опыление), Рождественское (Уэлси х ВМ 41497), Свежесть (сорт Антоновка красно-бочка х PR12T67). Их использование позволяет заявить, что в России ликвидировано отставание от других стран в создании собственных иммунных сортов яблони, хотя селекция по этому направлению была начата в нашей стране на 30-40 лет позднее. В продолжении селекционной работы планируется использовать уже созданные иммунные сорта с геном V f а также привлекать доноры иммунитета с геном V_r и другими генами и получать формы, гомозиготные по генам V f и V_r для их последующего использования в качестве доноров с целью увеличения выхода иммунных сеянцев и повышения уровня иммунитета. Кроме того, формируется генофонд на дигенной основе иммунитета (V f + V_r, V f + V_m, V_r + V m ). Сеянцы такого типа уже созданы (26) и в настоящее время проходят селекционную оценку.

Создание триплоидных сортов. Начало селекции яблони на полиплоидность в России было положено в 1970 году во ВНИИСПК. За период с 1970 по 2014 год в этих исследованиях осуществили 454 комбинации скрещиваний (657,9 тыс. опыленных цветков) и вырастили 42,4 тыс. однолетних сеянцев. После многократной выбраковки в теплице на искусственном инфекционном фоне и в школке в селекционные сады перенесено 14,7 тыс. сеянцев.

За весь период осуществили скрещивания с полиплоидными формами следующего типа: (4х) х (4х); (4х) х (3х); (4х) х (2х); (3х) х (2х); (3х) х (4х); (3х) х (3х); (3х) х (2х); (2х) х (4х); (2х) х (3х). Было установлено, что для получения триплоидных сеянцев в гибридном потомстве ценны варианты (2х) х (4х) и (4х) х (2х). Наибольшее число триплоидных сеянцев в опыте было получено от скрещивания (2х) х (4х). Это связано с тем фактом, что при выборе для гибридизации материнского родителя (4х) в качестве донора диплоидных гамет из-за его, как правило, повышенной самоплодности в потомстве получается много тетрапло-идных сеянцев, малоинтересных в селекционном отношении, и невелико число триплоидных форм. При необходимости проводить скрещивания типа (4х) х (2х) для получения триплоидных сеянцев необходима кастрация цветков у тетраплоидного материнского родителя.

Цитоэмбриологическое изучение особенностей формирования репродуктивной сферы у полиплоидных форм яблони при оценке их пригодности для гетероплоидных скрещиваний позволило планировать подбор комбинаций скрещивания, определить объем гибридизации и прогнозировать ее результаты.

Во ВНИИСПК цитоэмбриологический контроль в селекции полиплоидных форм проводится с 1976 года, а скрещивания разнохромосом- ных форм начаты еще раньше — с 1970 года. За этот период было осуществлено 455 комбинаций скрещивания, опылены 659615 цветков, выращены 47927 однолетних сеянцев и после выбраковки высажены в селекционный сад 13202 сеянца. Всего плоидность определили у 14,5 тыс. растений из 430 семей (27-29).

Мейоз при микроспорогенезе изучали у 18 тетраплоидных форм, из которых 5 были периклинальными химерами первого типа и 13 — гомогенными тетраплоидами. По числу нарушений эти 18 форм разделились на три группы (табл. 1).

1. Тип и число нарушений на последовательных стадиях мейоза у тетраплоидных форм яблони (Malus domestica Borkh.), полученных в результате гибридизации (Всероссийский НИИ селекции плодовых культур)

Рис. 1. Нормальный микроспорогенез у тетраплоидной формы яблони (Malus domestica Borkh.) 20-9-27: а — метафаза I; б — анафаза I; в — телофаза I; г — метафаза II; д — анафаза II; е — телофаза II; ж — тетрады; з — пыльца (Всероссийский НИИ селекции

Форма	Нарушений по стадиям мейоза, %	Нарушений в среднем по всем стадиям, %
	MI | AI | TI | MII | AII | TII | тетрады

I группа

25-37-45 (4х) 19,8 10,5 3,8 8,4 5,3 11,8 15,2 10,7 Сорт Папировка (2-4-4-4х) 35,5 30,5 4,9 9,0 14,5 3,3 1,7 14,2 25-35-144 (4х) 11,6 34,9 7,2 38,9 15,7 8,2 5,1 17,4 25-37-47 (4х) 17,5 34,1 9,1 22,5 22,5 8,7 10,9 17,9 25-35-121 (4х) 22,4 19,9 5,2 11,9 23,1 12,0 31,7 18,0 20-9-27 (4х) 22,0 36,1 6,2 33,1 28,8 7,7 7,2 20,2 II г р у п п а Сорт Спартак (4х) 24,4 32,9 11,6 29,0 24,2 14,2 28,0 23,5 13-6-106 (4х) 18,5 36,4 22,8 54,6 24,2 22,4 8,7 26,8 25-37-40 (4х) 31,7 33,0 18,3 43,6 45,8 23,5 11,7 29,7 25-35-120 (4х) 29,8 51,6 23,4 29,8 30,3 21,7 21,2 29,7 25-37-35 (4х) 37,7 31,9 14,4 43,0 22,9 27,9 44,4 31,7 Сорт Уэлси-М (2-4-4-4х) 72,0 33,1 22,4 43,4 28,6 6,4 18,6 32,1 Сорт Джаент Спай (2-4-4-4х) 63,4 34,0 13,8 53,9 39,3 16,2 7,5 32,6 Сорт Мелба (4х) 38,5 40,7 16,0 38,3 46,9 17,0 30,7 32,6 Сорт Антоновка плоская (2-4-4-4х) 61,2 41,1 33,9 45,3 44,7 22,4 6,4 36,4 30-47-88 (4х) 38,7 44,1 19,9 51,3 32,5 27,2 46,4 37,2 III г р у п п а Сорт Уэлси-F (2-4-4-4х) 76,0 66,7 20,0 51,8 44,3 34,5 28,0 45,9 Сорт Мекинтош (4х) 75,5 51,3 25,6 51,2 55,6 72,0 96,7 61,1 плодовых культур, окрашивание по С.Г. Каптарь, 1967; микроскоп Nikon-50i, «Nikon Co.», Япония).

В I группе частота нарушений на исследованных стадиях микроспорогенеза составляла 10-20 %, во II, наиболее многочисленной, — 2040 %. В самой малочисленной III группе формы характеризовались наибольшей частотой нарушений (40-60 %). Наиболее приближенным к норме был мейоз у форм 25-37-45 (4х), Папировка (4х), 20-9-27 (4х). На всех стадиях мейоза у них преобладали микроспороциты с правильным делением (рис. 1).

На рисунке 2 представлены некоторые наиболее характерные нарушения в процессе микроспорогенеза у разных тетраплоидных форм.

Рис. 2. Примеры характерных нарушений на стадиях микроспорогенеза у тетраплоидных форм яблони (Malus domestica Borkh.): а — анафаза I, отставание (30-47-88, 4х); б — телофаза I, микроспороцит крупнее обычного (сорт Мелба, 4х); в — анафаза II, мост (25-37-47, 4х); г — гексада (сорт Спар-тан, 4х) (Всероссийский НИИ селекции плодовых культур, окрашивание по С.Г. Каптарь, 1967; микроскоп Nikon-50i, «Nikon Co.», Япония).

В результате специфических нарушений у некоторых тетраплоидных форм часть пыльцы будет содержать гаплоидное число хромосом. Это следует учитывать при планировании скрещиваний с такими формами.

В скрещиваниях типа (2х ) х (4х ) наиболее высоким выходом три-плоидов в гибридном потомстве характеризовались формы 25-37-47, Уэл-си-F, Папировка (2-4-4-4х), Джаент Спай и 30-47-88. Доля триплоидных сеянцев в гибридных семьях с их участием достигала соответственно 84,0; 81,0; 77,6; 78,8 и 68,1 %.

Особый интерес представляет новая форма 30-47-88 (Либерти х 13-6106). Сеянец 13-6-106 получили от посева в 1971 году семян диплоидного сорта Суворовец. Из 1957 сеянцев один оказался гомогенным тетраплои-дом. В 1994 году сеянец был выделен в доноры диплоидных гамет и использован в качестве отцовского родителя в скрещивании Либерти (ген V f х 13-6-106. Из 31 полученного однолетнего сеянца отобрали тетрапло-идный сеянец 30-47-88 — комплексный донор диплоидных гамет и гена иммунитета к парше. Масса его плодов составляет 180 г, внешний вид и вкус оцениваются на 4,3 балла. Описанный пример показывает, что на селекционное создание некоторых доноров (пребридинг) может понадобиться более продолжительное время, чем на получение собственно сорта.

С участием этого донора диплоидных гамет и колонновидных форм получены гибридные сеянцы, сочетающие в одном генотипе ген ко-лонновидности (Со), ген иммунитета к парше (Vе) и триплоидность. Такие сеянцы до сих пор неизвестны в селекционной практике. В перспективе из этого гибридного материала должны быть выделены новые сорта, при годные для возделывания в садах интенсивного типа.

С использованием доноров диплоидных гамет в разнохромосомных скрещиваниях сортов и форм впервые в России и в мире создана серия из 15 триплоидных сортов, девять из которых уже включены в Государственный реестр селекционных достижений (районированы): Августа (Орлик х Папи-ровка тетраплоидная), Александр Бойко (Прима х Уэлси тетраплоидный), Бежин луг (Северный синап х Уэлси тетраплоидный), Дарёна (Мелба х Па-пировка тетраплоидная), Масловское (Редфри х Папировка тетраплоидная), Орловский партизан (Орлик х 13-6-106), Осиповское (Мантет х Папировка тетраплоидная), Патриот [(Антоновка краснобочка х SR 0523) х 13-6-106 (сеянец сорта Суворовец)], Яблочный Спас (Редфри х Папировка тетраплоидная). Из девяти перечисленных триплоидных районированных сортов три (Александр Бойко, Масловское и Яблочный Спас) одновременно обладают тройным набором хромосом (3х) и иммунитетом к парше (ген Vf.

В некоторых случаях возможно получить иммунные к парше трип-лоидные сорта и от двух диплоидных сортов, если один из родителей обладает геном иммунитета (например, геном V ) и этот же или другой родитель склонен к образованию нередуцированных гамет. Примером тому могут служить созданные нами и включенные в Государственный реестр селекционных достижений два иммунных к парше триплоидных сорта — Рождественское (Уэлси х ВМ 41497 ( V f ) и Юбиляр [(814 (V f — свободное опыление].

Колонновидные сорта. За последние годы садоводам стали известны колонновидные сорта яблони, относящиеся к новой биологической форме растений. Колонновидные сорта имеют ряд преимуществ. Они дают возможность в значительной степени интенсифицировать все процессы по производству плодов, получать уже на 3-5-й год после закладки сада существенный урожай, значительно сократить и упростить ручной труд по уходу за садом, в частности сократить или полностью исключить работы по обрезке и формированию кроны деревьев, позволяют в значительной степени уменьшить пестицидную нагрузку в саду и его окрестностях.

Во ВНИИСПК целенаправленная селекционная работа по созданию колонновидных сортов начата в 1984 году (30, 31). За весь период (1984-2014 годы) была проведена гибридизация по 145 комбинациям скрещивания, опылено 184,8 тыс. цветков, получено 87,3 тыс. нормально развитых семян, выращено 33,1 тыс. сеянцев. После многократных выбраковок двулетних сеянцев в селекционные сады перенесено 2717 сеянцев. К настоящему времени из восьми созданных сортов (Восторг, Гирлянда, Есения, Зеленый шум, Памяти Блынского, Поэзия, Приокское и Созвездие) два (Приокское и Поэзия) уже включены в Государственный реестр селекционных достижений (районированы). Сорта Восторг и Созвездие проходят государственное, остальные — первичное сортоиспытание.

Лучшие из перечисленных колонновидных сортов могут служить донорами для дальнейшей селекции. В перспективе заманчиво получить колонновидные триплоидные сорта с генетической устойчивостью к парше. Особую ценность при выполнении этой задачи представляет комплексный донор 30-47-88 (Либерти х 13-6-106) — одновременно донор диплоидных гамет и иммунитета к парше.

Схема получения гибридов яблони, совмещающих колонновидность, иммунитет к парше и триплоидный набор хромосом

Колонновидные сорта и формы (с геном Со ): Валюта, Приокское, Поэзия, Созвездие, Стела, Стрела и др.

30-47-88 (ген V_f + 4х)

^х     [Либерти (V_f) х 13-6-106 (4х)]

Сеянцы, совмещающие в своем генотипе колонновидность (ген Со ), иммунитет к парше (ген V f и тройной набор хромосом (3х)

От такого типа скрещиваний за 2010-2014 годы получено 8885 семян и выращено 2152 сеянца.

Таким образом, разработанные инновационные направления в селекции яблони с целью создания сортов нового поколения позволили получить формы с геном иммунитета к парше ( V f , колонновидности ( Со) и с тройным набором хромосом (Эх), и форму, которая одновременно служит донором диплоидных гамет и иммунитета к парше. Их использование в комбинациях скрещиваний позволит получать принципиально новые сорта с высокой конкурентной способностью и комплексом необходимых хозяйственных признаков, не уступающие зарубежным сортам по урожайности, технологическим и потребительским качествам плодов, но существенно превосходящие их по адаптивности.