О накоплении зеараленона в травяных кормах и токсинообразующей активности грибов рода Fusarium

Зеараленон (ЗЕН) как «эстрогенный кормовой фактор», образуемый грибами Fusarium , представляет серьезную угрозу для здоровья животных. Ситуации с массовым повреждением репродуктивных функций жвачных, лошадей и свиней были описаны в 1970-1980-е годы (1, 2), и подобные сообщения продолжают появляться (3). Частая встречаемость ЗЕН в высушенных травах была установлена в Сербии (4) и позднее — в Ирландии (5). При этом нередко отмечали случаи очень интенсивного накопления — до нескольких тысяч микрограммов на 1 кг сухого материала (1, 4). Похожую ситуацию мы наблюдали для сена из хозяйств европейской России: в большинстве образцов количество ЗЕН было ниже 100 мкг/кг, но в отдельных случаях оно превышало 1000 мкг/кг (6). Несмотря на реальную угрозу интоксикаций скота при использовании таких кормов, выяснению

Исследование частично финансировано за счет гранта Российского научного фонда (проект ¹ 14-1600114).

причин столь высокой контаминации уделялось недостаточно внимания.

Нельзя исключать, что эффект аномального накопления мог быть вызван процессом напочвенного высушивания зеленой массы. На практике его условия неодинаковы и варьируют по продолжительности от нескольких суток до недель в зависимости от погодных и хозяйственноорганизационных причин. Следовательно, первым шагом к пониманию этого феномена должно стать сравнение контаминации сырья перед заготовкой и по окончании сушки.

Целью нашей работы стало изучение встречаемости и содержания зеараленона в травостоях злаковых и бобовых культур в летне-осенний период и в сене разного ботанического состава, а также сравнительная оценка токсинообразующей способности грибов Fusarium , инфицирующих сельскохозяйственные растения.

Методика. Средние образцы сена были взяты от 120 партий, заготовленных в хозяйствах из 30 районов Московской области в 2013 году. Дикорастущие растения (вейник, гребенник, душистый колосок, двукис-точник, ежа, костер, мятлик, овсяница, полевица, пырей, тимофеевка, щетинник — всего 211 образцов) отбирали в Каширском, Ногинском и Рузском районах в июне—сентябре 2014 года. Образцы луговых трав (всего 427 образцов) были собраны также в Северной Карелии, Ленинградской, Тверской и Астраханской областях с 1998 по 2014 годы с разной повторяемостью по годам и видам растений. В этих выборках, наряду с повсеместно встречающимися травами (костер, мятлик, овсяница, пырей, тимофеевка), присутствовали растения локального распространения — вейник (везде, кроме Северной Карелии), двукисточник (Северная Карелия, Ленинградская обл.), ежа (Ленинградская и Тверская области), полевица (Северная Карелия, Тверская обл.), тростник (Тверская и Астраханская области), а также найденные на отдельных территориях ко-лосняк (Северная Карелия), гребенник, овес, райграс, клевер, чина, горошек, вика (Тверская обл.), рожь, пампасская трава, щетинник, люцерна (Астраханская обл.).

Свежесобранные образцы трав высушивали при 50 ° С, измельчали ножницами, а затем размалывали на лабораторной мельнице. Подготовленный материал экстрагировали смесью ацетонитрила и воды в объемном соотношении 86:14 при расходе экстрагента 10 мл на 1 г навески.

В работе использовали штаммы 13 видов грибов Fusarium из коллекции лаборатории микологии и фитопатологии Всероссийского НИИ защиты растений (г. Санкт-Петербург). Инокулюм представлял собой 1012-суточную моноспоровую культуру гриба, выращенную на картофельно-сахарозном агаре. В стерильные стеклянные флаконы с плоским дном, закрытые ватно-марлевыми пробками, вносили 1 мл картофельно-сахароз-ного агара и проводили посев инокулюма гриба. Для предотвращения высыхания питательной среды пробки флаконов оборачивали пленкой Parafilm (США). Через 7 сут (по окончании культивирования) во флакон добавляли по 1 мл смеси ацетонитрила и воды в объемном соотношении 86:14 и интенсивно встряхивали в начале и конце стационарной 14-16часовой экстракции. При сравнительной оценке токсинообразующей способности видов Fusarium и дифференциации культур по интенсивности ток-синообразования применяли терминологию, предложенную в специальной литературе (7, 8).

Содержание ЗЕН определяли с помощью коммерческой тест-системы для непрямого конкурентного иммуноферментного анализа Зеара-ленон-ИФА (Россия), которая обеспечивала нижний предел определе- ния 20 мкг/кг в растительных объектах и 4 нг/мл — в мицелиально-споровой биомассе грибов (9).

Результаты. В течение всего периода наблюдений с июня по сентябрь в вегетирующих луговых травах ЗЕН встречался с частотой 18 % (38 образцов из 211) и в основном в количествах ниже 100 мкг/кг. Тем не менее, в 18 % образцов от числа положительных его содержание было существенно выше с предельно достигаемым значением 5760 мкг/кг (табл. 1). Интересно, что по месяцам сбора при варьировании частоты встречаемости этого микотоксина от 10,6 до 27,3 % наблюдалось его постепенное накопление. Так, в июне содержание ЗЕН было ниже 100 мкг/кг. В июле отмечали единичные случаи, когда значения превышали 100 мкг/кг, а в августе и сентябре появились образцы, содержащие более 1000 мкг/кг этого фузариотоксина. Иными словами, неоднородный характер загрязненности ЗЕН с редкими случаями сверхвысокого накопления формировался в луговых травах к концу вегетации. Значительное содержание ЗЕН было выявлено у пырея, тимофеевки и мятлика, что свидетельствует в пользу микогенной, а не фитогенной природы этого феномена.

1. Встречаемость и содержание зеараленона в луговых травах и заготовленном сене (Московская обл., 2013-2014 годы)

Объект, время сбора, число образцов	n +	n +, содержание зеараленона
		20-100 мкг/кг 1	> 100 мкг/кг	> 1000 мкг/кг
Луговые травы ( n = 211):	38	31 (25-99)	3 (117-146)	4 (1060-5750)
июнь, n = 92	16	16 (27-56)	–	–
июль, n = 55	15	12 (52-99)	3 (117, 126, 146)	–
август, n = 47	5	2 (25, 26)	–	3 (1060, 2000, 5760)
сентябрь, n = 17	2	1 79	–	1 1520
Сено, n = 120	54	30 (20-89)	17 (100-870)	7 (1320-10000)

П р и м е ч а н и е. n — число проанализированных образцов , n + — число образцов, содержащих токсин. Прочерк означает, что положительных проб не обнаружили. В скобках указано содержание зеараленона (минимум-максимум).

Характер контаминации сена, судя по результатам анализа образцов от 120 производственных партий, оказался аналогичным описанному ранее на сборной выборке с разных территорий (6). В основном загрязнение микотоксином было умеренным, но сопровождалось отдельными случаями высокого накопления токсина. Всего ЗЕН выявили в 45 % образцов, при этом более половины из них содержали меньше 100 мкг/кг, в остальных количество микотоксина было на порядок больше, а в 13 % оно превышало 1000 мкг/кг. В одной пробе сена из многолетних трав этот показатель достигал 10000 мкг/кг. Случай такого же сверхвысокого загрязнения сена ЗЕН ранее описан финскими учеными (1). В Словении при обследовании высушенного травостоя кукурузы этот токсин встречался в количествах 200-700 мкг/кг, изредка — более 10000 мкг/кг (4).

Результаты, полученные на материале с одной и той же территории в разные сезоны, свидетельствовали о том, что в целом характер контаминации вегетирующих и заготовленных на корм трав имел черты сходства: при средних показателях встречаемости преобладало низкое содержание ЗЕН, сопровождавшееся накоплением значительного количества микотоксина в некоторых образцах.

Состояние травостоев во второй половине вегетации на конкретной территории может служить ориентиром в оценке риска загрязнения токсином сухих травяных кормов. В этой связи интересны результаты, полученные по другим ареалам. Так, при анализе дикорастущих злаков из Северной Карелии и Ленинградской области (n = 177) не было зафиксировано ни одного случая обнаружения ЗЕН. В Тверской области в июле 2011 года, а также в июле и сентябре 2014 года контаминация оказалась слабо выраженной — только в 12 пробах из 100 при количестве 45-105 мкг/кг. Напротив, в Астраханской области (n = 150) уже в первых сборах в сентябре 1999-2000 годов отмечали высокую загрязненность тростника — 767, 3020 и 10000 мкг/кг. В 2005 и 2009 годы были выявлены единичные положительные образцы. К сожалению, мы не имели возможности провести подобные обследования в Брянской области, где впервые установлена высокая загрязненность сена — до 2000 мкг/кг (6). Отметим, что для прогнозирования конкретной ситуации по каждой территории необходимы репрезентативные выборки растений, составляющих основу естественных местных травостоев.

Несмотря на явное сходство между вегетирующими и высушенными на корм растениями, в сене наблюдалось возрастание частоты выявления ЗЕН, а также доли образцов с высокой степенью контаминации и предельным накоплением. Вероятно, это связано с активацией метаболизма грибов, способных к биосинтезу микотоксина, в процессе провяливания и высушивания. В частности, L.E. Taffarel с соавт. показали (10), что содержание ЗЕН выше в траве, высушенной на солнце при резкой смене дневных и ночных температур, а не в тени (10).

В заражении растений может участвовать значительное число видов Fusarium . Изучению их токсигенности посвящено много работ (11, 12), однако в отношении потенциала образования ЗЕН полной ясности пока нет и какие-либо однозначные выводы делать преждевременно. Оценочные эксперименты проведены в основном при выращивании грибов на стерилизованных зерновых субстратах при 15-27 ° С в течение нескольких недель. Установлено, что этот токсин с разной интенсивностью продуцировали представители 8 видов: F. graminearum Schwabe, F. culmorum (W.G. Sm.) Sacc., F. sporotrichioides Sherb., F. poae (Peck) Wollenw., F. arthro-sporioides Sherb., F. avenaceum (Fr.) Sacc., F. langsethiae Torp et Nirenberg, F. tricinctum (Corda) Sacc., наиболее распространенных в зерне в Финляндии (13, 14). Тем не менее, среди штаммов F. culmorum , F. equiseti (Corda) Sacc. и F. avenaceum , выделенных из всходов озимой пшеницы в Московской области, продуценты выявлены не были (15). У видов, инфицирующих зерно в том же регионе, ЗЕН в небольших количествах найден только у 3 изолятов F . culmorum из 11, а среди F . avenaceum , F. sporotrichioides , F . poae продуцентов не оказалось (16). F . sporotrichioides , F. poae , F. equiseti , F . acuminatum Ellis et Everh. в составе микобиоты зерна из других областей характеризовались низким накоплением этого метаболита (17, 18). Среди 76 изолятов F. graminearum , которые были получены из фузариозного зерна, выращенного в Краснодарском крае, более половины образовывали ЗЕН (19).

2. Количество зеараленона, продуцируемое коллекционными штаммами Fusarium при 7-суточном культивировании на картофельно-сахарозном агаре при 23-24 ° С (лабораторный опыт)

Вид Fusarium n+/n n+, количество зеараленона 10 нг/мл 100 нг/мл 1000 нг/мл 10000 нг/мл F. graminearum 61/74 12 (2-70) 32 (105-813) 14                    3 (1100-7080)    (11480, 12880, 41200) F. equiseti 14/14 1 50 4 (170-830) 7 (1050-3470) 2 (12590, 39810) F. semitectum 27/30 - 11 (130-880) 4 (1260-5125) 12 (16220-181970) F. cerealis 18/26 4 (30-80) 13 (100-795) 1 (1260) – F. culmorum 15/16 5 (40-80) 10 (157-616) – – F. sporotrichioides 3/43 2 (11, 19) 1 (190) – – F. poae 3/46 3 (10, 12, 40) – – – П р и м е ч а н и е. n — число проанализированных образцов мицелиально-споровой биомассы гри- ба, n+ — число образцов, содержащих зеараленон. Прочерк означает, что положительных образцов не обнаружили. В скобках указано содержание зеараленона (минимум-максимум).

У F. cerealis (Cooke) Sacc. и F. culmorum частота обнаружения ЗЕН была достаточно высокой при его содержании в основном от 100 до 1000 нг/мл. В сопоставимых по объемам выборках F. sporotrichioides и F. poae лишь редкие штаммы образовывали этот токсин и, как правило, в низких концентрациях (10-40 нг/мл). Среди представителей видов F. an-guioides Sherb. ( n = 20) и F. langsethiae ( n = 17) продуцентов не оказалось.

В немногих доступных для обследования культурах F. heterosporum Nees et T. Nees ( n = 6), F. chlamydosporum Wollenw. & Reinking ( n = 2) и F. kyushuense O’Donnell & T. Aoki ( n = 2) ЗЕН не обнаружили. Для единственного исследованного штамма F. flocciferum Corda была установлена высокая активность биосинтеза этого метаболита (15500 нг/мл).

Исходя из полученных результатов, к числу возможных источников накопления ЗЕН в травах могут быть отнесены F. graminearum , F. equiseti и F. semitectum. Интересно заметить, что из тростника в Астраханской области, интенсивно контаминированного ЗЕН, были получены изоляты Fusarium sp., предположительно принадлежащие к виду F. graminearum и активно продуцирующие этот метаболит как на зерновом субстрате, так и на агаризованной среде. При микологическом анализе пробы сена из Брянской области, содержащей токсин в количестве 2000 мкг/кг, также получили изолят того же вида . Ранее было показано, что при понижении температуры инкубации до 22 ° С способность к накоплению ЗЕН у F. gra-minearum существенно возрастает (20). Возможно, он особенно подвержен изменению метаболических путей под влиянием условий развития. Ясность в эту проблему может внести изучение генных механизмов регуляции биосинтеза ЗЕН у F. graminearum , проводимое в последнее время (21, 22).

Уточнение видового состава и биосинтетических возможностей грибов Fusarium, представленных в микобиоте травяных культур, остается задачей будущих исследований. В этой связи большое значение имеет идентификация составляющих ее организмов с учетом последних достижений в области хемотаксономической и молекулярно-генетической дифференциации грибов (23, 24), а также изучение факторов, под влиянием которых возможна активация соответствующих участков геномов.

Таким образом, для вегетирующих луговых растений и сена установлены черты сходства и различия по частоте встречаемости и содержанию зеараленона — фузариотоксина с эстрогенным действием, а также обозначены основные методологические подходы, необходимые для выяснения причин, вызывающих интенсивное накопление микотоксина в травяных кормах. Решение этой проблемы позволит устранить или существенно снизить угрозу микогенных интоксикаций, приводящих к нарушению репродуктивной функции животных.

Л И Т Е Р А Т У Р А

• ¹ФГБНУ Всероссийский НИИ ветеринарной          Поступила в редакцию
  
  санитарии, гигиены и экологии,                      3 сентября 2014 года

  123022 Россия, г. Москва, Звенигородское ш., 5, e-mail: kononenkogp@mail.ru ;

• ²ФГБНУ Всероссийский НИИ защиты растений,

  196608 Россия, г. Санкт-Петербург—Пушкин,

ш. Подбельского, 3,

Sel’skokhozyaistvennaya biologiya / Agricultural Biology , 2015, V. 50, ¹ 2, pp. 255-262

ABOUT ZEARALENONE LEVELS IN GRASS FODDERS AND TOXINE PRODUCING ACTIVITY OF Fusarium FUNGI

• ¹All-Russian Research Institute of Sanitary, Hygiene and Ecology, Federal Agency of Scientific Organizations, 5, Zvenigorodskoe sh., Moscow, 123022 Russia, e-mail kononenkogp@mail.ru ;

• ²All-Russian Research Institute of Plant Protection, Federal Agency of Scientific Organizations, 3, sh. Pod-bel’skogo, St. Petersburg, 196608 Russia, e-mail t.gagkaeva@mail.ru

  Supported in part by Russian Science Foundation (project ¹ 14-16-00114)

Адрес сайта журнала в Интернете — Статьи, события, информация — 7500 просмотров за месяц 73 % — посетители из России, около 7 % — из США и Канады, 20 % — из других стран

О ЖУРНАЛЕ

РЕДСОВЕТ ПРАВИЛА

:еаьскохозяйственная

Российская академия сельскохозяйственных

Научно-теоретический журнал

Включен в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий в Российской Федерации, в которых должны быть опубликованы основные результаты диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук (Перечень ВАК) (по агрономии и лесному хозяйству, по зоотехническим и ветеринарным специальностям, а с 2007 года — также по биологическим наукам).

КАРТА САЙТА

Сообщаем, что...

е В правилах оформления направлений к представляемым рукописям произошли изменения

Динамичное развитие и высокий уровень публикаций определяют интерес к изданию и его признание в научной среде. Читатели журнала — ученые не только из России и стран СНГ, но и из Бразилии, Великобритании, Германии, Испании, Китая, Швейцарии, Японии,

• ■ На сайте открыт новый раздел _

• - ■’Зарубежные публикации", в^{с 1989 г}°Д^а журнал выходит двумя сериями:

котором представлены «Биология растений» (№№ 1, 3 и 5 - февраль, июнь и октябрь) публикации авторов журнала «Биология животных» {№№ 2, 4 и б - апрель, август и декабрь) в зарубежных изданиях

• ■ Изменился фактический адрес Индекс журнала в Объединенном каталоге «Российские и зарубежные редакции, Корреспонденцию газеты И журналы» — 70804.

можно отправлять по адресу:

127434, Москва, Дмитровское Подписка через Интернет-каталог.

шоссе, д, 11, оф, 343.

• • Телефонный код редакции

изменился на 499, Новые телефоны: (499) 976-32-73; (499) 977-88-19.

^РУКОНТ

НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦИФРОВОЙ РЕСУРС

Third International Conference on Integration of Science and Technology for Sustainable Development

(ICIST2014)

November 27-28,201 -I

Pakse. Champasak. lao PDR

Партнеры Авторы Контакты