О подвижности ионов при электрофорезе в однородной жидкости и в пористых средах в случае линейной зависимости скорости от амплитуды вектора электрической напряженности

Одним из методов секвенирования ДНК является электрофорез. При этом важнейшим параметром процесса секвенирования является подвижность составляющих ДНК — нуклеотидов. В настоящей работе рассматривается эволюция постепенного усложнения такой величины, как подвижность ионов при электрофорезе, последовательно для однородной непористой среды, для пористой среды общего вида и, наконец, для пористой среды применительно к электрофорезу нуклеотидов. При этом принимается допущение о линейной зависимости скорости включений (ионов) от амплитуды вектора постоянной электрической напряженности. В качестве альтернативы показано, что в нелинейном случае зависимости миграционной скорости от амплитуды вектора постоянной электрической напряженности подвижность ионов перестает быть постоянной и зависит от этой амплитуды.

ОСНОВНЫЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Изложение дальнейшего материала следует работам [1–4]. Приведем некоторые определения и соответствующие выражения, описанные в этих работах.

Пористость (porosity) — m . В случае однородного пористого материала объемом V при объеме пор V _p пористость этого образца равна [2, с. 9]

V p m = — .

V

Пористость является безразмерной величиной со значениями в интервале m е [0,1].

Характерный размер пор — d [2, с. 10]. Введение характерного размера пор может быть произведено неоднозначно, однако определение такой величины бывает удобно для оценок по порядку при анализе уравнений (см., например, [2, с. 27, 28]).

Просветность (surface porosity) — n . Если сделать мысленный поперечный разрез образца пористой среды, то в образовавшемся сечении площадью S часть площади S _p будет приходиться на поры. Отношение

Sp n = —

S

называется просветностью [2, с. 11]. Среднее значение просветности для большого набора параллельных сечений какого-либо фиксированного образца равно пористости этого образца [2, с. 11]. Это свойство позволяет приближенно считать пористость и просветность практически равными величинами для реальных пористых сред со случайной структурой: n ® m [2, с. 11].

Фильтрация жидкости в пористой среде. При описании фильтрации жидкости в пористой среде применяются различные модели (уравнения) баланса импульса (см., например, [3, 4]). Исторически первым уравнением баланса импульса для случая медленного стационарного движения несжимаемой жидкости в неподвижной изотропной пористой среде было уравнение Дарси. Далее последовали его модификации (уравнение Дарси— Форхгеймера, уравнение Бринкмана и т.д.). В частности, в уравнении Бринкмана сохранения баланса импульса

V p = - — u + n A u            (3)

k присутствуют два вязкостных члена: η, имеющий смысл обычной динамической вязкости для жидкости, заполняющей пористое пространство, и П, называемый коэффициентом эффективной вязкости. Имеет место соотношение [3, с. 15]

П 1 = .

η mT

Здесь T ^* — извилистость (tortuosity) порового пространства. Таким образом, отношение П / п зависит от геометрии пространства. Оно может быть как больше, так и меньше единицы, и П / п ^ 1 при m ^ 1. В (3) Р — давление в жидкости; u — осредненная скорость движения жидкости; k — коэффициент, называемый проницаемостью пористой среды и зависящий от типа пористой среды.

Коэффициент проницаемости — k. Коэффициент проницаемости k зависит только от свойств пористой среды и определяется в основном геометрией порового пространства. Он имеет размерность площади, а его величина имеет порядок квадрата характерного размера пор [2, с. 16] d : k ~ d2. В работах [3, с. 13]; [4, с. 41] дано более детальное выражение m3d2 к =---------2 ,

а ( 1 - m )

где α — константа, определяемая геометрией скелета.

Для неоднородных пористых сред коэффициент проницаемости является функцией пространственных координат и может меняться во времени к = к ( x , y , z , t ) (например, при деформациях пористого скелета, или за счет его засорения, или растворения). То же относится, очевидно, и к пористости и просветности.

Подвижность — u. Подвижностью u называется средняя (дрейфовая) скорость компонента в растворе при действии на него объемной силы единичной величины независимо от происхождения этой силы. Размерность объемной силы при этом может меняться, например, быть в Н/м³.

Такое определение соответствует предположению о линейной зависимости между скоростью компонента (иона, диэлектрической частицы и т.д.) и приложенной силой. Подвижность в этом случае является постоянным коэффициентом пропорциональности между силой и скоростью.

Существуют разнообразные определения подвижности. Приведем примеры из [1], где, согласно приведенному выше, подвижность определяется из моделей, в которых скорость миграции связана с силой линейным соотношением, коэффициент которого и определяет подвижность. Далее полагаем, что v — локальная скорость жидкости. Различают следующие определения подвижности.

• -    Стоксова подвижность рассматривается в случае баланса какой-либо сторонней силы F , действующей на шарик радиусом a , помещенный в жидкость с динамической вязкостью η и силой сопротивления Стокса, возникающей при движении шарика со скоростью v при малых числах Рейнольдса (ползущее течение). Этот баланс определяется соотношением [5, с. 93]

F = 6пцаv, откуда получаем v = z ' F ,(4)

6πηa а отсюда подвижность u0 (см. также [6, с. 192])

u 0 =------.(5)

^St 6 πηa

• -    Электроосмотическая подвижность

eo выводится также в предположении ползущего течения [6, с. 159]; [7, §63], т.к. уравнение баланса импульса рассматривается для условия малости числа Рейнольдса. Поскольку электроосмотическая скорость вне диффузного слоя определяется в системе СИ выражением [6, с. 159]

U. = '"   E ,               (6)

η где ζ — электрокинетический потенциал (дзета-потенциал) [8, с. 34]; ε , ε0 — диэлектрическая проницаемость среды и электрическая постоянная соответственно; E — вектор напряженности электрического поля. Отсюда

u

eo

εε ₀ ζ ^η

• -    Электрофоретическая (ионная) подвижность u ₀ заряженной частицы (в предположении ep_ion

ползущего течения сферической частицы радиусом a и зарядом Ze , где e — элементарный заряд (заряд протона), Z — валентность иона) в электрическом поле напряженностью E в стоксовом приближении определяется из уравнения [6, с. 144]

F el + F drag = Ze E - 6nna U_M n = 0

или

U i _On = / e E .

6 πηa

Откуда для частицы следует выражение для ионной электрофоретической подвижности

Ze u о =----- ^epion   6 πηa

.

Это частный случай стоксовой подвижности, когда сила F определена равенством F = Ze E . Однако, как видно из сравнения (5) и (9), множитель Ze из соображений удобства вынесен в выражение для подвижности.

• -    Электрофоретическую подвижность диэлектрической частицы, окруженной двойным электрическим слоем (ДЭС) u , можно определить ep_d

из соотношения для скорости электрофоретической миграции в электрическом поле напряженностью E [7, с. 232]; [8, с. 39]:

U ep d

εε 0 ζ _E ^η

откуда следует электрофоретическая подвижность диэлектрической частицы

u

0 ep_d

εε ₀ ζ ^η

Здесь ζ — дзета-потенциал в ДЭС диэлектрической частицы. При выводе этого выражения в [7, § 63, 64] также предполагается приближение ползущего течения.

Как отмечается в [8, с. 40], имеет место соот-1

ношение u_n / u_n ®----, где Я — дебаевская

0epd     0epion a / λ длина в ДЭС [7, с. 97]; [8, с. 16]. Таким образом, подвижность u (11) диэлектрической частицы epd с суммарным электрическим зарядом окружающего ее двойного электрического слоя (ДЭС) Q в поле E в a / λ раз меньше подвижности иона u (9) с тем же зарядом Q, что объясняется epion тормозящим влиянием диффузного слоя ДЭС [8, с. 40].

Подвижность при нелинейной зависимости между скоростью компонента и силой. Рассмотрим нелинейный закон зависимости между средней скоростью компонента и модулем вектора электрической напряженности (см., например, в [8, гл. 10]):

v = й E " e = й E" " 1 E e = й E" " 1 E ,

E e = E , E = |E| .

В этом случае при формальном определении подвижности u _n при приложении поля Eⁿ e из вышеприведенного выражения имеем

~ T7 " — 1 u _n = uE .

Здесь й — скорость компонента при E = 1, т.е. подвижность, которая была бы в случае, если зависимость между скоростью и электрической напряженностью линейна; u _n — нелинейная подвижность при приложении поля Eⁿ e . Как видно из последнего соотношения, подвижность в нелинейном случае u _n перестает быть постоянной и становится зависимой от подвижности й в линейном случае, умноженной на амплитуду электрического поля в степени E " " 1 . Этот факт необходимо учитывать для наращивания подвижности ионов в случае нелинейной зависимости между скоростью компонента и модулем вектора электрической напряженности.

ПОДВИЖНОСТЬ В ПОРОВОМ ПРОСТРАНСТВЕ

Выше были приведены подвижности частиц и ионов в свободной однородной среде. В [1] был предложен правдоподобный подход, позволяющий переходить от подвижности в беспоровом пространстве к подвижности в поровом пространстве. При формулировке этого подхода за основу было взято выражение для макроскопической подвижности при фильтрации жидкости в пористом пространстве, определяемой законом Дарси, следующим из выражения (3) в случае, когда членом П А и в (3) можно пренебречь [1, выражение (8)]

k u = —V p . ^η

Тогда, если сила, приложенная в этом выражении, равна F = -Vp, то подвижность u0, как следует из ее определения, равна скорости при единичном значении силы k u 0 =-, η т.е. определяется наряду с величиной динамической вязкости η коэффициентом проницаемости k , характеризующим свойства пористой среды и пропорциональным площади характерного поперечного сечения пор d2 . Очевидно, электрофорез в пористой среде можно трактовать как фильтрацию ионов в пористой среде, тогда уместно введение коэффициента, пропорционального площади поперечного сечения ионов. Такой коэффициент был введен в [1], обозначенный через χ и названный коэффициентом проникновения частиц. Согласно [1], величина χ определена в интервале X е[1,да]. Коэффициент x трудноизмерим. Гораздо более удобен безразмерный коэффициент [1]

лась необходимость указывать радиус иона (молекулы) a . Такой радиус называют гидродинамическим радиусом, радиусом Стокса, или радиусом Стокса—Эйнштейна. Его вычисление использует уравнение Нернста—Эйнштейна [7, с. 258]. Для радиуса иона, который полагается сферическим, в работе [3, с. 117] приведено его эффективное значение

kT a = ——,

6 πηD

где D — коэффициент диффузии для молекул (ионов) данного вида; k _B — постоянная Больцмана; T — абсолютная температура.

k p = k / X ,               (12)

с областью определения k _p е [0, k ], который харак-

теризует степень пропускания конкретных частиц (ионов) данным поровым пространством и является относительной величиной, зависящей от соотношения характерных размеров порового пространства и конкретных частиц или ионов.

В частности, для случая ионной подвижности в [1] приведено следующее выражение:

~

u

0 ^ep ion

Ze

= k ----= k — p 6πηa     p epion

.

Таким образом, ионы, имеющие физические размеры, которыми пренебречь нельзя, имеют подвижность U₀ в пористом пространстве, в k ^ep ion                                                                      p

О ПОДВИЖНОСТИ НУКЛЕОТИДОВ В ПОРИСТЫХ СРЕДАХ

В работах [9–12] подробно рассматриваются вопросы, связанные с электрофорезом в пористых средах вообще, а в работах [9, 10] — с вопросами подвижности ионов в пористых средах. В частности, в работе [9] приведены следующие выражения, связывающие подвижности ионов в пористой среде и в свободной жидкости. Далее примем их обозначения соответственно через u и u ₀ .

Так, в работе [9] приводится соотношение Ог-стона (Ogston) ([9, выражение (9)])

- = exp ( - K r C ) , # (16) u ₀

где K _R — коэффициент замедления (retardation coefficient) пористой структуры, пропорциональный величине K _R~ ( R _D + r ) 2 , где R _D — радиус вращения ДНК-молекулы; r — радиус гелиевых волокон; C — концентрация геля.

Модель Oгстона (16) была изначально разработана для движения сферических объектов в случайном массиве цилиндрических препятствий, где

раз меньшую подвижности этих же ионов в однородной жидкости u . Заметим, что величина k 0epion                                                           p является безразмерной величиной:

k = - p    u0epion

.

О ГИДРОДИНАМИЧЕСКОМ РАДИУСЕ МОЛЕКУЛЫ (ИОНА)

При обсуждении в [1] вопроса о вычислении подвижности молекулы (иона) в беспоровом [1, (22)] и поровом [1, (31)] пространствах отмеча-

# Подвижности u и u о имеют одинаковую размерность, следовательно, агрегат exp ( - K _R C ) должен быть безразмерным. Кроме того, величина K _R C должна быть безразмерной как аргумент экспоненциальной функции, которая всегда безразмерна. В противном случае размерность агрегата exp ( - K _R C ) состоит из бесконечной суммы всех степеней произведения ( K _R C ) n , n = 0,1,2,...), а следовательно, безразмерной должна быть и величина K _R C , что не сходится с размерностями величин K и C .

R

размер пор следует пуассоновской статистике. Во-вторых, неясно, можно ли смоделировать быстро вращающуюся жесткую стержнеобразную короткую молекулу ДНК в качестве так называемой "эквивалентной сферы". Поэтому в контексте разделения ДНК в запутанных растворах полимеров, можно говорить только об Огстон-подобном механизме просеивания.

Модель (16) некорректно описывает подвижность больших ДНК в геле. Для описания подвижности в геле длинных молекул была предложена так называемая модель рептации (biased reputation model — BRM). Для BRM-моделей при не очень сильном электрическом поле были предложены следующие выражения для электрофоретической подвижности ДНК:

и / u =----+ £, 1 < N < ND

0 3ND   9

для ДНК меньше критической длины N _D^* ([9, выражение (10)]) и

ε2      1

u / u0 ~ 9 3N ’ ND > ND

Как и в случае (17), (18), подвижность ДНК обратно пропорциональна их длине, однако для случая ДНК большой длины и/или большого электрического поля подвижность становится прямо пропорциональной величине электрического поля и от длины ДНК перестает зависеть (см. (20)), и разделение ДНК разной длины невозможно.

В тугих гелях ( a <  1) при N _D <  N _D подвижность по-прежнему определяется выражением (19), однако для больших ДНК имеются три режима [9, выражения (14а), (14b), (14c)]:

и / и ₀ « £а ^1/2, £ <  a ^7/2,

/         (     -4 \^2/ 5        .      .      7/2

и / и 0 ~ (£a ) , a > £ > a , и / и 0 ® £2, £ > a .

В [10, § 1.2] автор подробнее комментирует некоторые из выражений (16)–(23).

Таким образом, вопросы подвижности ДНК в различных пористых структурах (см. библиографию, например, в работах [9, 10]) достаточно хорошо изучены и представлены в научных изданиях.

для ДНК длиной больше критической длины N _D^* ([9, выражение (11)]). Здесь N _D = M _D / M _a — безразмерный масштаб, равный отношению размера ДНК M _D к частичному его размеру M _α , вписывающемуся в одну пору; ε — относительная (безразмерная) величина, пропорциональная приложенному электрическому полю.

Далее были получены выражения для подвижностей ДНК с учетом влияния флуктуации длины ДНК. Эта модель включила два различных случая: первый, когда величина пор a матрицы больше размера пор ДНК b _D ( a = a / b _D >  1), и второй случай, когда размер пор матрицы меньше размера пор ДНК ( a = a / b _D <  1, т.н. плотные гели). В этих двух случаях снова различают два режима: малые длины ДНК ( N _D <  N D ) и большие длины ДНК ( N _D >  N D ), в которых справедливы соответствующие выражения для подвижностей ДНК [9, выражения (12), (13)]:

О ПОДВИЖНОСТИ НУКЛЕОТИДОВ В СВОБОДНОЙ ЖИДКОСТИ

В результате проведения опытов на генетическом анализаторе "Нанофор 05" в капиллярах, наполненных только буферной жидкостью, был выявлен следующий эффект. Все ионы в результате движения по капилляру приходили к детектору, отстоящему на величину l ₀ от начала капилляра, кучно, не разделяясь, примерно в одно и то же время в виде колокола с малой дисперсией. Это может говорить об очень близких величинах подвижности всех ионов в свободной жидкости при отсутствии пористости.

Возьмем отношение подвижностей i -го и j -го ионов

u / u ₀

3 N D ^,

N D <  N D ^D

для ДНК меньше критической длины N _D^* и

и / и ₀ ~ £

(

V

1 2 N D ε

N D >  N D ^D

для ДНК больше критической длины N _D^* .

u0i Ze    Ze   Z  Z epion    i ______j __ ___i_ /  j ^ 1

u _{0 j}      6 πµa_i 6 πµa _j   a_i   a_j ^,       (24)

i , j _ 1, N .

Это в свою очередь говорит о том, что справедливо соотношение

Z Z _j

— ~ — ~ const, i , j _ 1, N .

a i     a j

Таким образом, получается, что в случае рассматриваемого здесь электрофореза в свободной жидкости отношение валентности ионов Z_i к их гид-

родинамическому радиусу a_i , i = 1, N сохраняется близким к постоянному, и тогда, согласно (24), и подвижность этих ионов примерно одинакова. Это подтверждает невозможность секвенирования нуклеотидов в свободной жидкости.

ВЫВОДЫ

В работе приведены различные виды подвижности включений и ионов в однородной жидкости и в пористой среде, заполненной жидкостью, а также необходимые определения, касающиеся свойств пористых сред. Основное внимание уделено ионной электрофоретической подвижности в однородной жидкости и в пористой среде для случая линейной зависимости между миграционной скоростью и амплитудой вектора напряженности электрического поля. Приведены результаты, касающиеся моделей подвижности нуклеотидов в различных случаях. Необходимо иметь в виду, что в случае нелинейной зависимости миграционной скорости и амплитуды электрического поля подвижность перестает быть постоянной и становится зависимой от этой амплитуды. Приведен ряд других фактов, касающихся вопросов подвижности. Результаты работы полезны для исследователей, занимающихся секвенированием ДНК.

Работа выполнена в ИАП РАН в рамках Государственного задания 075-00780-20-00 по теме № 0074-20190013 Министерства науки и высшего образования.