О состоянии почвенных азотфиксирующих бактерий на территории городского леса

листвением крон. Городские леса сибирского мегаполиса - г. Новосибирска - в этом отношении не исключение. Особую обеспокоенность представляют лесные массивы научного центра, на территории которого в последние два десятилетия возросли рекреационные и транспортные нагрузки, увеличилась плотность административной и жилой застройки, что негативно отразилось на состоянии лесов Академгородка, которое оказалось порою катастрофическим [Таран, 2013].

С целью сохранения уникального объекта в марте 2014 г. управление по государственной охране объектов культурного наследия по Новосибирской обл. включило Академгородок вместе с его природными ландшафтами и лесами в перечень объектов культурного наследия региона [Здания и леса ...].

Новосибирский Академгородок был создан в середине XX в. по особому проекту как город-лес с чередованием жилых кварталов и массивов лесных насаждений, окружен широкими полосами сосновых боров и лесопарком Ботанического сада. При разработке Верхней зоны научного центра архитекторы вписали в естественный ландшафт административно-жилые комплексы и объекты озеленения с максимальным сохранением лесов. В середине 70-х гг. XX в. Академгородок представлял образец сочетания вековой тайги, лесопарка и современного города. К настоящему времени выявлено ухудшение состояния ценнейшего природоохранного объекта в связи с антропогенными нагрузками и отсутствием необходимых уходов за лесом, понизивших сопротивляемость деревьев к вредителям и возбудителям болезней. Среди приоритетов в ведении лесного хозяйства отмечается повышение плодородия почв и ограничение рекреационной и транспортной нагрузки. Особенно это касается лесов Верхней зоны и прилегающего к ней Пироговского лесного массива, которые расположены в границах традиционной территории Новосибирского научного центра. Здесь же расположен национальный научно-исследовательский университет, численность студентов которого в последние годы возросла.

С конца XX в. на данной территории были предприняты неоднократные попытки оценить экологическое и лесорастительное состояние почв. Были установлены изменения физико-химического статуса почв, выявлено локальное повышение содержания в них тяжелых металлов и токсичных микромицетов [Сысо, Смоленцев, Артамонова, 2013]. Установлено влияние автотранспортных и рекреационных нагрузок на альгологическую и микробиологическую характеристику почв, метаболическую активность аэробных азотфиксирующих микроорганизмов [Артамонова, 2002]. О снижении биогенного азота в городских почвах сообщалось и для других сибирских регионов [На-прасникова, Данько, 2000].

Цель данной работы - подробный анализ со стояния и развития свободноживущей азотфикси-рующей бактерии Azotobacter chroococcum, запаса жизнеспособного пула олигонитрофильных бактерий, обилия аммонифицирующей бактерии Bacillus mycoides и содержания бактероидов на корнях бобовых растений. Интерес к бактероидам (клубеньковым бактериям) обусловлен тем, что они участвуют в симбиотической фиксации азота, поставляют биогенный азот растениям и педобио-те. О присутствии диазотрофных бактерий, включая Azotobacter, на поверхности корней растений и в соприкасающейся с ними почве сообщалось ранее [Блэк, 1973]. Азотобактер способен проявлять положительный хемотаксис к веществам корневых выделений [Mandimba, Heulin, Bally et al., 1986], может использовать экссудат корней как источник энергии и трофического материала. Однако сведений о поведении азотобактера в почвах лесных экосистем, испытывающих транспортное загрязнение и рекреационные нагрузки, недостаточно. Наряду с этим, нами проанализированы взаимоотношения азотобактера с фузариозными микромице-тами, содержание которых в почвах сибирского мегаполиса велико [Артамонова, 2002; Артамонова и др., 2007; Артамонова, Лютых, Смирнова, 2009]. Антифунгальный эффект был выявлен ранее в почвах г. Перми [Артамонова, Еремченко, 2015]. В предлагаемой работе мы использовали те же подходы, что и для почв селитебнотранспортной зоны, прилегающей к Черняевскому лесу уральского мегаполиса.

Материалы и методы исследования

В настоящей статье приведены результаты обследования почв лесных экосистем Верхней (центральной) зоны Новосибирского Академгородка и ее окрестностей. Территория зоны расположена на водораздельном плато, расчлененном овражнобалочной сетью, а ее окраины примыкают к пологому делювиальному шлейфу, граничащему с террасами р. Оби. На данной территории развиваются смешанные березово-сосновые травяные и сосновые леса с кустарничково-травяным покровом.

По степени антропогенной нарушенности исследованные лесные массивы отнесены к слабо нарушенным естественным лесам и нарушенным лесам «буферной» зоны [Лащинский, Макунина, Мальцева, 2013].

В центральной части лесного массива, который представляет группу слабонарушенных лесов, нами выделен контрольный участок, как наименее подверженный антропогенным нагрузкам (точка № 4). Влияние выраженной рекреационной нагрузки на такие леса было изучено на участках, расположенных вблизи границ ЦСБС СО РАН, в районе р. Зырянка (точки № 10, 11). Воздействие транспортного загрязнения исследовано на примере придорожных лесных экосистем, испытывающих преимущественное загрязнение автомобильными эмиссиями (точки № 2, 3). Также рассмотрено влияние припаркованного к окраине леса маршрутного автотранспорта (автостоянка, Цветной проезд). В последнем случае имеет место комплексное загрязнение лесных экосистем эмиссиями автотранспорта и горюче-смазочными материалами (точка №5).

В группе нарушенных лесов «буферной» зоны изучены участки, расположенные вблизи институтов и административных учреждений по пр. Лаврентьева. Все они в той или иной мере испытывают комплексное воздействие автотранспорта и рекреации (точки №1,8, 9).

Наряду с облесенными территориями, нами обследованы участки со следами сведенного леса: на въезде в Академгородок и в районе Технопарка (точки 6, 7). Места отбора почвенных образцов для бактериологического анализа представлены на картосхеме (рис. 1).

Для бактериологического анализа почвенные образцы отбирались с глубины 0-10 см согласно нормативным требованиям [Гигиеническая..., 1999]. В дальнейшем образцы почв просеивались через почвенное сито № 2. Полученная мелкозёмистая фракция подвергалась бактериальному и химическому анализу. Определение встречаемости азотобактера в пробах мелкозёма определяли традиционным методом обрастания комочков [Красильников, 1958]. Предварительно пробу мелкозема (около 2 мг каждая порция) в 50-кратном количестве помещали на твердую безазотистую питательную среду Эшби, находящуюся в чашках Петри, в 3-4-кратной повторности [Бабьева, Агре, 1971]. Чашки с мелкоземом, содержащим азотобактер, помещали в термостат на сутки при t = 28°С [Сэги, 1983], поскольку рост азотобактера был активным. Через сутки содержимое чашки фотографировали, изображение переносили в программу «Corel», затем на экране монитора оконту-ривали границы бактериального ореола вокруг комочка мелкозема и границы самого комочка мелкозема. С помощью заданных функций компьютерной программы определяли площадь того и другого.

Метод учета бактериальных обрастаний почвенных или мелкоземистых комочков (масс, порций) наиболее приближен к естественным условиям [Алексеева, 2005]. Он обеспечивает выявление азотобактера и других бактерий в почвенных пробах даже при низком содержании микроорганизмов. Число обросших комочков (частота колонизации, обилия) встречается в списке критериев оценки биологической активности почв [Методические указания..., 2003]. Показатель подавления (в процентах) числа обрастаний включен в список эколого-гигиенических показателей класса опасности отходов производства и потребления [СП

2.1.7.1386-03.].

Рис. 1. Карта-схема размещения точек отбора почвенных проб:

1 - лесная буферная зона между’ ИЯФ СО РАН и пр. Лаврентьева; 2 - придорожная экосистема около леса, пр. Строителей; 3 - придорожная экосистема около леса, ИПА СО РАН; 4 - лес между ИНА СО РАН и ул. Пирогова; 5 - автостоянка около леса, Цветной проезд,; 6 - придорожная экосистема, технопарк; 7 - придорожная экосистема на въезде в Академгородок на перекрестке Бердского шоссе и пр. Строителей; 8 -лесная буферная зона около ИНХ СО РАН; 9 - лесная буферная зона, ул.

Терешковой; 10 - лес, около границы ЦСБС СО РАН, пойма р. Зырянки; 11- лес, ул. Золотодо-линская, берег р. Зырянки

В последние годы показатель встречаемости азотобактера (по числу обрастаний) используют в индикации химического загрязнения почвы [Мын-баева, Курманбаев, Воронова, 2011], выявлении изменений биологических свойств почв, загрязненных тяжелыми металлами [Капралова, 2012], в оценке экологического состояния почв, загрязненных нефтепродуктами и тяжелыми металлами [Феоктистова, 2012], в оценке токсичности антиго-лолёдных средств [Коньшина, 2014]. Однако учет ореола роста азотобактера вокруг почвенных комочков производится редко в силу технических сложностей. Мы заимствовали компьютерный подход, распространенный в картографическом учете выделов (площадей). Запас жизнеспособных олигонитрофильных бактерий рассчитывали по числу колониеобразующих единиц (КОЕ) на среде Мишустиной [Клевенская, 1985].

Для учета встречаемости аммонифицирующей бактерии Bacillus mycoides использовали метод обрастания мелкозёмистых комочков, предварительно размещенных на мясопептонном агаре (МПА) [Мишустин, 1972]. Регистрировали частоту обрастания мелкозёма бактерией и полиморфность её колоний.

Содержание бактероидов определяли на корнях клевера красного летом и осенью. С этой целью растения выкапывались (по 4 штуки в каждом конкретном случае), и в лабораторных условиях учитывалось число присутствующих на корнях клубеньков.

Для выявления отсутствия или присутствия антагонизма между азотобактером и микромицетами использовали метод «почвенного сэндвича» и метод «подсадки» [Сэги, 1983], когда на газон мик-ромицетов или рядом с ним помещаются диски культуры бактерии.

Содержание химических элементов определяли методом РФА-СИ для твердых проб на станции ВЭ1111-3 Института ядерной физики СО РАН. Предварительно почвенные пробы высушивали при комнатной температуре, затем измельчали до размера менее 0.1 мм. Порция порошка 30 мг спрессовывалась в таблетки диаметром 10 мм при давлении 100 кг/см2. Измерения проведены при энергии активации 30 keV. Применялся метод внутренних стандартов. Обработка эмиссионных спектров проводилась с помощью программы AXIL. Стандартные образцы СГХМ-4, СДО-4и РУС-1 выбирались в качестве образцов сравнения [Арнаутов, 1990]. Чувствительность определения элементов на базе СИ -0.1 г/т. Результаты исследований обрабатывались с применением математической статистики и корреляционного анализа (программы Statistica 6.0).

Результаты и их обсуждение

Исследованные почвы относятся по показателям состава и свойств поверхностных горизонтов (табл. 1) в среднем к слабокислым, мало- и среднегумусовым, супесчаным дерново-подзолистым. Это предполагает их малую устойчивость к основным видам антропогенного воздействия, имеющим место на территории Академгородка.

Наши исследования показали, что в почвах исследованных слабонарушенных лесов и нарушенных лесов «буферной» зоны азотобактер и олиго-нитрофильные бактерии обнаружены повсеместно. Встречаемость азотобактера - 100%-ная. Присутствие ореола роста бактерии вокруг мелкозёмистых частиц независимо от места отбора пробы постоянно регистрировалось через 24 ч. (и=150), что свидетельствует о высокой скорости размно жения азотобактера. Однако в точке № 5, где присутствует комбинированное воздействие транспортного загрязнения, и в точках № 6, 7, где лес ранее был сведен, рост азотобактера ослаблен (рис. 2). В почве контрольного участка (точка № 4) и почвах нарушенных лесов «буферных» зон (точки № 1-3) азотобактер развивается лучше. Средние статистические значения площади бактериального ореола вокруг мелкозема в точках № 5, 6, 7 составляют 142.8-154.7 мм2, в то время как в точках № 1-4, диапазон шире: 121.3-163.1 мм2 (табл. 2). Можно предположить, что в последней группе точек отбора проявилось позитивное влияние леса.

Таблица 1

Статистические показатели состава и свойств поверхностных горизонтов (или слоев) почв ННЦ (п=117) [Сысо, Смоленцев, Артамонова, 2013]

Показатель	Пределы значений		M±G	v, %
	min	max
pH водный	4.48	8.00	6.62±0.81	12
pH солевой	3.99	7.98	6.13±1.16	19
Гумус, %	0.29	13.16	3.26±2.29	70
Физическая глина, %	1.69	27.3	12.19±5.17	42

№ точки

Рис. 2. Рост азотобактера вокруг 1 мм2 мелкозёма, сут.:

1 - лесная буферная зона между ИЯФ СО РАН и пр. Лаврентьева; 2 - придорожная экосистема около леса, пр. Строителей; 3 - придорожная экосистема около леса, ИПА СО РАН; 4 - лес между ИПА СО РАН и ул. Пирогова; 5 -придорожная экосистема около леса, Цветной проезд, автостоянка; 6 - придорожная экосистема, технопарк; 7 - придорожная экосистема на въезде в Академгородок на перекрестке Бердского шоссе и пр. Строителей

Диапазон средних величин площади мелкозема имеет схожую тенденцию. В точках № 5-7 он составляет 163.1-192.9 мм2, в то время как в точках № 1-4, он шире: 186.0-254.5 мм2. Суммарная площадь мелкозема и ореола в точках № 5-7 составила 306-348 мм2, в то время как в точке № 3 достигла максимума - 398 мм2. Следовательно, техногенное загрязнение, которое имеет место на участке парковки автотранспорта и на участках сведения леса, негативно отражается на жизнедея- тельности азотобактера. Судя по данным вероят- оказались ниже порога значимости при достаточно ности равенства средних значений (табл. 3), полу- низкой ошибке. Можно допустить, что с увеличе-ченные результаты обнаруживают достоверные нием выборки они могут превзойти выбранный различия. Следует сказать, что некоторые данные порог значимости.

Таблица 2

Статистические показатели роста азотобактера, сут., п=150

№	S	М±о	и, %	Доверительный интервал		НСР р0,05
				-95,0%	+95,0%
1	О	126.4+19.0	15.0	118.7	134.1	7.7
	м	254.5+45.6	17.9	243.9	265.1	10.6
	к	380.9+157.5	15.1	375.2	386.6	5.7
2	о	121.3+21.1	17.4	89.3	153.2	32.0
	м	186.0+51.9	27.9	131.3	240.7	54.7
	к	307.3+68.4	22.3	220.7	393.9	86.6
3	о	163.1+27.9	17.1	145.1	181.1	18.0
	м	235.4+38.3	16.3	210.7	260.1	24.7
	к	398.4+55.2	13.8	356.3	440.5	42.1
4	о	150.9+21.4	14.2	129.6	172.2	21.3
	м	209.6+37.7	18.0	178.9	240.3	30.7
	к	360.4+50.0	13.9	308.4	412.5	52.0
5	о	154.7+20.7	13.4	135.9	173.5	18.8
	м	192.9+41.9	21.7	168.8	216.9	24.1
	к	347. 6+52.8	15.2	304.8	390.4	42.8
6	о	146.0+24.3	16.6	100.3	191.7	45.7
	м	178.0+38.6	21.7	121.5	234.4	56.4
	к	324.0+59.4	18.3	221.9	426.1	102.1
7	о	142.8+28.3	19.8	96.3	189.4	46.6
	м	163.1+41.6	25.5	109.5	216.7	53.6
	к	306.0+60.7	19.8	206.0	405.9	100.0

Примечание. № - номер точки отбора пробы; S - площадь, мм2; О - площадь ореола бактерии; М - площадь мелкозёма; К - суммарная площадь (О+М).

Таблица 3

Вероятность равенства средних значений площади бактериального ореола

№	1	2	3	4	5	6	7
1		0.62	0.00*	0.03*	0.01*	0.07	0.12
2	0.62		0.00*	0.01*	0.00*	0.02*	0.05*
3	0.00*	0.00*		0.25	0.42	0.11	0.06
4	0.03*	0.01*	0.25		0.71	0.64	0.44
5	0.01*	0.00*	0.43	0.71		0.41	0.26
6	0.07	0.02*	0.11	0.64	0.41		0.76
7	0.12	0.05*	0.06	0.44	0.26	0.76

Примечание. № - номер точки отбора пробы; * - достоверное различие, р = 0.05.

Ингибируют рост азотобактера группа тяжелых металлов, содержание которых, судя по геохимическому анализу почвенных проб, возрастает в присутствии техногенного загрязнения, особенно в точке № 5 (табл. 4). Здесь повышенное содержание Си, Zn, Pb. Вместе с тем, выявленные концентрации тяжёлых металлов соответствует диапазону ПДК и ОДК, приведённому ранее для почв данной территории [Богуславский, Зольников, Лямина, Сысо, 2013], а также не выходят за пределы кларковых значений для городских почв [Алексеенко и Алексеенко, 2013].

Сравнение скорости роста азотобактера летом и осенью в прикорневой зоне клевера красного по данным площади ореола вокруг мелкозема обна ружило схожую тенденцию негативного влияния транспортного загрязнения на бактерию (рис. 3). При этом содержание бактероидов в летний период имело четкую обратную зависимость (табл. 5). Осенью же содержание бактероидов на корнях клевера красного в обстановке техногенного загрязнения заметно снизилось, но тенденция роста азотобактера осталась прежней. Осенью бактероиды побурели, стали сплющенными в виде бляшек размером около 0.3-0.5 мм, в то время как в отсутствии транспортного загрязнения они оставались бледно-розовыми, округлыми и меньшего размера (около 0.1 мм).

Можно предположить, что техногенное загрязнение привело к ускоренному старению клубень- ков, потере ими способности фиксировать атмо- нений вокруг них.

сферный азот, снижению запаса азотистых соеди-

Рис. 3. Рост азотобактера в присутствии бактероидов на корнях клевера красного (и=4):

4 - лес между ИПА СО РАН и ул. Пирогова; 5 - придорожная экосистема около леса, Цветной проезд; 6 -придорожная экосистема, технопарк. А - площадь ореола азотобактера вокруг 1мм2 мелкозёма, сут.; Б -число бактероидов на 1 растение; ■ - лето, ■ - осень

Таблица 5

Статистические показатели содержания бактероидов на корнях клевера красного (в шт./ растение), п=4

Таблица4

Геохимический состав в поверхностном слое (0-10 см) почв ННЦ, мг/кг (по данным РФА-СИ, аналитик Ю.П. Колмогоров)

Элемент	№ пробы			Кларк*
	4	2	5
К,%	1.26	1.04	1.0	1.34
Са,%	1.35	6.44	6.91	5.38
Мп,%	0.081	0.051	0.032	0.073
Бе,%	2.07	1.54	1.40	2.23
V	58	35	29	100
Сг	47	47	56	290
№	29	39	28	33
Си	14	20	44	39
Zn	55	62	93	160
Pb	13	18	53	55
Ga	10	7.9	9.4	16
Ge	1.2	1.9	2.8	1.8
Rb	58	44	41	58
Sr	150	140	150	460
Y	38	24	12	23
Zr	182	88	87	260
As	5.0	12	<0.01	16
Mo	2.0	1.8	3.9	2.4

- по данным В.А. Алексеенко и А.В. Алексеенко [2013].

№ точки	Время отбора	Пределы значений, min-max	М±о	HCP0, 05
4	Л	135-155	144±8.5	13.59
	О	230-265	246±14.9	23.76
5	Л	150-220	185±31.1	49.47
	о	65-82	72±7.8	12.42
6	л	175-205	193±13.2	21.05
	о	95-115	109±9.5	15.06

Примечание. Л - лето, О - осень.

Анализ олигонитрофильных бактерий показал, что пул колониеобразующих единиц во всех исследованных почвенных пробах остается на уровне экологической значимости [Звягинцев, 1987], но на уровне бедных и очень бедных почв [Звягинцев, 1991]. Наибольший пул жизнеспособных бактерий обнаружен в точке № 5 (рис. 4), в остальных случаях он ниже. В составе жизнеспособного пула олигонитрофильных бактерий во всех ситуациях присутствуют карликовые формы, что свидетельствует об остром дефиците биогенного азота в почве.

2,50 п

пай

11 9 10 8 5 № точки

Рис. 4. Жизнеспособный пул олигонитрофильных бактерий, млн. КОЕ/ г мелкозёма:

Я - типичные формы, О - карликовые формы.

Точки отбора проб: 5 - придорожная экосистема около леса, Цветной проезд; 8 - лесная буферная зона около ИНХ СО РАН; 9 - лесная буферная зона, ул. Терешковой; 10 - лес, около границы ЦСБС СО РАН, пойма р. Зырянки; 11 - лес, ул.

Зол отодолинская, берег р. Зырянки

Он формируется уже на этапе аммонификации азотсодержащих соединений вследствие роста Bacillus mycoides, не способной утилизировать минеральный азот. Встречаемость этой бактерии 100%-ная, причем этот потребитель аммонийного азота фенотипически изменен: в техногенно загрязненной среде обитания он имеет выраженную ризоидную структуру колоний в отличие от типичной нитчатой формы.

Подобная адаптация бациллы к техногенному загрязнению была обнаружена нами в почвах, прилегающих к автомагистралям г. Перми [Артамонова, Еремченко, 2015]. Что касается компенсации биогенного азота с экзометаболитами азотобактера, то, скорее всего, она замедлена, поскольку в присутствии Си и Ее, которых в наших пробах немало (см. табл. 4), скорость распада этих органических соединений может снижаться до 50% [Тейт, 1991].

Выявленные взаимоотношения азотобактера с фузариозными грибами неоднозначны. Штаммы азотобактера, выделенные из почв с техногенным загрязнением, в присутствии микромицетов этих же почв, не проявили антифунгальный эффект.

Однако эти же штаммы азотобактера в присутствии микромицетов, выделенных из контрольного участка, характеризуются ускоренным ростом и выраженным разрушением поверхности колонии грибов. Агрессивный характер азотобактера, в данном случае, обусловлен, скорее всего, приобретенной адаптацией к токсичной среде обитания. Выживанию и росту бактерии в техногенной среде способствует ослизнение и пигментирование, а также продукты распада углеводородных соединений, разлагаемых микромицетами [Билай, Коваль, 1980]. В свою очередь, микромицеты сами используют азотистые соединения азотобактера. Ускоренный рост азотобактера в присутствии техногенного загрязнения - это, возможно, проявление его экологической тактики. Подобная способность увеличивать радиальный рост колоний выявлена для актиномицетов [Соловьева, 2015] в городских условиях обитания.

Заключение

Таким образом, свободноживущие и симбиотические азотфиксирующие бактерии почв слабона-рушенных и нарушенных «буферных» лесов обнаруживают ухудшение состояния при техногенном загрязнении среды обитания. Наибольшее снижение роста азотобактера выявлено на фоне комплексного загрязнения почв автомобильными эмиссиями и горюче-смазочными маслами. Содержание тяжелых металлов (Си, Pb, Zn) в поверхностном слое (0-10 см) возрастает суммарно в 2.6 раза по сравнению с контрольным лесным участком. Поведение азотобактера на фоне данного загрязнения аналогично таковому в придорожных участках со сведенным лесом. В нарушенных «буферных» лесах воздействие автомобильных эмиссий и рекреационной нагрузки оказывает меньшее воздействие на рост азотобактерии.

Снижение развития азотобактерий негативно отражается на запасе в почвах всех лесов жизнеспособных олигонитрофильных бактерий. Их пул соответствует бедным и очень бедным почвам, хотя и сохраняет экологическую значимость. Этому способствует полиморфизм бактерий, выживание их в преданабиотическом состоянии, о чем свидетельствует измельчение колоний до «карликовых» форм. Диссоциирование обнаружено также у диазотрофных и аммонифицирующих бактерий. Культурально-морфологические изменения азотобактера в техногенно загрязненной почве выражаются в ослизнении и пигментировании колоний. Особенностью диссоциированных штаммов является отсутствие антифунгального эффекта в присутствии фузариозных микромицетов и выраженный антагонизм по отношению к грибам контрольного лесного участка.

Таким образом, адаптация азотобактерий к техногенному загрязнению лесных местообитаний обеспечивает им высокую встречаемость. Однако развитие бактерий ослаблено, что не способствует пополнению почв биогенным азотом, необходимым корням растений. Для улучшения качества среды обитания диазотрофных бактерий и повышения их азотфиксирующей активности необходимо ограничить техногенные нагрузки в пределах транспортно-коммуникационных сообщений. Сохранение природного микробного ресурса, участвующего в пополнении почв азотом, фиксированным из атмосферы, будет способствовать устойчивости деревьев лесных экосистем к антропогенным нагрузкам и фитопатогенам.