О токсичности и прооксидантном эффекте наночастиц CeO2 и SiO2 (на модели Danio rerio)

По некоторым оценкам, к 2020 году развитие нанотехнологий обеспечит создание отраслей промышленности, в которых будет занято около 6 млн человек с совокупным производством товаров на 3 трлн долларов (1). Закономерно увеличится поступление ультрадисперсных материалов в окружающую среду, где они будут вовлекаться в биологические процессы. В водной среде наноматериалы могут быть включены в различные процессы, например быть компонентами сточных вод или выбросов; они не подвергаются биодеградации и крайне медленно покидают биологический цикл (2). Этим обусловлена необходимость изучить состояние объектов наземных и водных (природных и антропогенных) экосистем при воздействии наноматериалов — в первую очередь, тех форм, которые имеют значительный потенциал применения. К их числу относятся нанопрепараты, содержащие церий и кремний и используемые во многих биотехнологических и медицинских производствах (3). Исследования показали, что токсический эффект CeO2 и SiO2 обнаруживается только при размерах частиц

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект ¹14-36-00023). Анализ образцов ткани экспериментальных животных на содержание химических элементов проводили в лаборатории АНО «Центр биотической медицины», г. Москва (аттестат аккредитации ГСЭН.RU.ЦАО.311, Регистрационный номер в Государственном реестре РОСС RU. 0001.513118).

до 10 нм, однако точных сведений, подтверждающих их низкую токсичность для человека и животных, нет. Ограниченное число фундаментальных работ по действию наночастиц (НЧ) CeO2 и SiO2, противоречивость полученных данных, а также расширение сфер применения материалов на основе НЧ CeO2 и SiO2 обусловливают необходимость в биологической оценке таких наноматериалов, в том числе в объектах среды (4, 5).

Следует отметить, что сведения об эффектах церий- и кремнийсодержащих наночастиц неоднозначны. На примере пресноводной рыбы Catostomus commersonii показано, что эти наночастицы характеризуются нестабильным проявлением активности (6). Исследования на модели Danio rerio выявили отсутствие токсического и повреждающего влияния (7), продемонстрированы перспективы применения церийсодержащих наночастиц в лечебных целях (8). В то же время получили распространение данные о выраженной токсичности таких материалов, в частности была обнаружена способность НЧ CeO₂ вызывать легочные воспаления при тестировании на крысах (9), индуцировать оксидативный стресс и, как следствие, однони-тевые разрывы ДНК (10, 11).

При его оценке в качестве изучаемых параметров выступают продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ) в тканях гидробионтов — биоиндикаторов техногенного загрязнения водоема. Однако, анализируя эти результаты, важно учитывать, что фиксируемые показатели могут быть связаны не только с реакцией на антропогенное загрязнение, но и с эндогенными субстратами перекисного окисления в тканях.

Нами впервые изучено действия наночастиц диоксида кремния и церия в условиях водной среды с непосредственной оценкой ферментативной системы биоиндикаторного организма.

Цель работы заключалась в определении биологических эффектов наночастиц CeO2 и SiO2 в водной среде в зависимости от дозы препаратов и способа их поступления.

Методика. Исследования выполнены на модели Danio rerio возрастом 1 мес, отобранных по массе.

Препараты наночастиц SiO2 (d = 40,9 нм) и CeO2 (d = 15,8 нм), использованные в исследованиях, синтезированы газофазным методом в Центре коллективного пользования Казанского национального исследовательского технологического университета им. А.Н. Туполева. Материаловедческая аттестация препаратов включала электронную сканирующую и просвечивающую микроскопию на JSM 7401F и JEM-2000FX («JEOL», Япония), а также рентгенофазовый анализ (дифрактометр ДРОН-7, НПО «Буревестник», Россия). Атомно-силовую микроскопию проводили на микроскопе СММ-2000 (ОАО «ПРОТОН-МИЭТ», Россия). При сканировании использовали кантилеверы MSCT-AUNM («Park Scientific Instru-ments», США) с коэффициентом жесткости k = 0,01 Н/м и радиусом кривизны иглы 15-20 нм. Количественный морфометрический анализ полученных изображений выполняли с помощью штатного программного обеспечения микроскопа.

Аквариумных рыбок Danio rerio (вид пресноводных лучеперых рыб семейства Карповые) возрастом 1 мес ( n = 75) в течение 21 сут содержали в условиях одного аквариумного стенда (V = 300 л). Затем методом параналогов сформировали 5 групп (по n = 15), поместив каждую в отдельный аквариум (V = 10 л, плотность посадки 15 особей), в воду которого добавляли исследуемые наночастицы: в I группе — CeO₂ НЧ (10 мг/дм³), во II группе — CeO₂ НЧ (100 мг/дм³), в III группе — SiO₂ НЧ (10 мг/дм³), в IV группе — SiO₂ НЧ (100 мг/дм³); V группа — контроль (без добавления 922

наночастиц). После адаптации модельного объекта в течение 21 сут (предварительный этап эксперимента) наночастицы SiO₂ (SiO₂ НЧ) и CeO₂ (CeO₂ НЧ) в форме лиозолей вводили с кормом (личинки комаров Chironomidae ) каждые 7 сут (10 и 100 мг/дм³ корма по группам согласно схеме опыта; в контроле наночастицы не добавляли). Для подготовки лиозолей наночастицы диспергировали в воде и стерилизовали ультразвуком (УЗДН-2Т, «НПП Академприбор», Россия; f-35 кГц, 300 Вт, A-10 мкА, 30 мин). Длительность эксперимента составила 84 сут.

Токсическое действие нанопрепаратов оценивали по выживаемости тест-объекта, рассчитанной как процент живых особей в конце опыта от их исходного числа. Концентрации нанопрепаратов относили к следующим группам токсичности: для выживаемости биоиндикатора 0-39 % — Tox, 50 % — LC 50 , 40-69 % — LOEC и 70-100 % — NOEC.

При определении продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и состояния систем антиоксидантной защиты через 7, 14 и 84 сут гомогенизировали по 5 особей Danio rerio (TissueLyser LT, «Qiagen N.V.», Германия). Для приготовления вытяжки к 1 объему гомогената добавляли 9 объемов трис-буферного раствора (Tris-HCl — 50 ммоль/л, дитиотреитол DTT — 1,0 ммоль/л, EDTA — 1,0 ммоль/л, сахароза — 250 ммоль/л, рН 7,5). После центрифугирования (10 мин при 15000 об/мин) отбирали супернатант, в котором измеряли содержание малонового диальдегида (МДА), а также активность ключевых ферментов антиоксидантной защиты — каталазы (КТ, КФ 1.11.1.6) и супероксиддисмутазы (СОД, КФ 1.15.1.1), используя автоматический биохимический анализатор СS-T240 («Dirui Industrial Co., Ltd», Китай) и коммерческие биохимические наборы для ветеринарии («Randox Laboratories, Ltd», Великобритания).

В течение исследования поддерживали средние значения температуры 22±2 ° С, рН 7,3±0,07, концентрацию растворенного кислорода 5±0,2 мг/л; световой режим — 12/12 ч (день/ночь). Рыбок кормили каждые 2 сут. Условия выращивания и содержания объектов соответствовали правилам OECD (Organisation for Economic Co-operation and Development) (12). Эксперименты выполняли в соответствии с протоколами Женевской конвенции и принципами надлежащей лабораторной практики (Национальный стандарт Российской Федерации ГОСТ Р 534342009), а также с инструкциями «The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press Washington, D.C. 1996)». Уход за животными осуществлялся согласно правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ 3 51000.4-96).

Данные представлены в виде среднего ( M ) и стандартной ошибки среднего ( m ). Статистический анализ выполняли с использованием стандартных методик ANOVA (программный пакет Statistica 10.0, «StatSoft Inc.», США) и последующей оценкой надежности по критерию Тьюки (Tukey’s test of additivity») в программе SPSS 17.0 («IBM Corporation», США). Различия считались статистически значимыми при Р < 0,05.

Результаты. В нашем опыте в 1-е сут гибель рыб в присутствии наночастиц обоих элементов не отмечали (данные не приведены). Более длительное воздействие наночастиц повлияло на численность Danio rerio (рис. 1). Первые признаки токсического эффекта CeO₂ НЧ в дозе 10 мг/дм³ корма отмечали на 45-е сут, на 56-е сут численность сокращалась на 33 %, на 65-е сут — уже на 54 %, к 84-м сут зафиксировали гибель 100 % тест-объектов. При концентрации CeO₂ НЧ 100 мг/дм³ гибель Danio rerio констатировали к 80-м сут.

На 7-е и 28-е сут обе дозы CeO2 НЧ и SiO2 НЧ (10 и 100 мг/дм3)

относились к категории NOEC (выживаемость объекта в пределах 70-100 %). На 56-е сут по CeO2 НЧ обе дозы переходили в группу LOEC (концентрация, сохраняющая 40-69 % выживаемости объекта), тогда как по SiO2 НЧ — оставались в группе NOEC.

Рис. 1. Динамика численности биоиндикаторного объекта Danio rerio в зависимости от дозы наночастиц SiO 2 (1, 2) и CeO 2 (3, 4) , внесенных с кормом, и срока воздействия: 1, 3 — 10 мг/дм³, 2, 4 — 100 мг/дм³ ( n = 75).

Наконец, на 84-е сут у CeO2 НЧ обе дозы были токсичными (Tox — концентрации, при которых выживаемость объекта составляет 0-39 %), тогда как у SiO2 НЧ эффект дозы 10 мг/дм3 все еще оценивался как NOEC, и только для дозы 100 мг/дм3 категория токсичности изменялась на LOEC.

Отметим, что полученные в этих экспериментах данные о высокой ток- сичности наночастиц церия противоречили нашей рабочей гипотезе, ос-

нованной на цикле работ о способности CeO2 НЧ проявлять антиоксидантные свойства, действуя как аналог супероксиддисмутаз (СОД) и каталаз. Речь шла о нейтрализации свободных радикалов и защите клетки от окислительного повреждения (13). На этом основании авторы предлагали использовать CeO2 НЧ при лечении неврологических расстройств и для защиты клеток от излучения (13, 14). В то же время способность CeO2 провоцировать оксидативный стресс показана на культуре клеток (15, 16) и на модельных объектах — крысах (17, 18) и нематоде Caenor-habditis elegans (19).

Наши данные также демонстрируют необоснованность высказанных предположений (20) о биологической инертности наночастиц диоксида кремния. Так, контакт SiO₂ НЧ с тест-объектом проявился снижением выживаемости Danio rerio на 7 %, к концу эксперимента — на 33 %, хотя полной гибели тест-объекта мы не наблюдали. Ранее на фоне применения SiO₂ НЧ были выявлены хромосомные аберрации и развитие окислительного стресса (21, 22). На модели Сarassius auratus gibelio (карась) показана способность наночастиц Si/SiO₂ вызывать воспалительную реакцию (23). Сходные результаты получены и на других тест-объектах (24-26).

Контакт Danio rerio с CeO₂ НЧ и SiO₂ НЧ в течение первых 2 нед эксперимента сопровождался снижением со-

держания МДА во всех группах по сравнению с контролем (табл. 1). Так, на 7-е сут содержание МДА снизилось на 11 и 61 % относительно контроля при дозах CeO2 НЧ соответственно 10 и 100 мг/дм3. Для SiO2 НЧ динамика оказалась сходной — уменьшение содержания МДА на 7-е сут на 50,0 и 41,5 % при дозах со-

1. Содержание (мкмоль/л) малонового диальдегида в гомогенатах Danio rerio в зависимости от доз и времени воздействия наночастиц (НЧ) CeO 2 и SiO 2 ( M ± m , n = 75)

Нанопрепарат	10 мг/дм3	100 мг/дм3
	Н а 7-е сут
CeO 2 НЧ	0,615±0,011 ∗	0,269±0,006 ∗
SiO 2 НЧ	0,346±0,008 ∗∗	0,404±0,003 ∗∗
Контроль	0,691±0,005
	Н а 14-е сут
CeO 2 НЧ	0,245±0,003 ∗∗	0,251±0,004 ∗
SiO 2 НЧ	0,252±0,005 ∗	0,269±0,006 ∗
Контроль	0,461±0,008
	Н а 84-е сут
SiO 2 НЧ	4,100±0,105 ∗	4,500±0,095 ∗∗
Контроль	0,693±0,001
∗ , ∗∗ Различия с контролем статистически		значимы соответ-
ственно при Р < 0,05 и Р < 0,01.

ответственно 10 и 100 мг/дм3. К 14-м сут эксперимента та же динамика со- хранялась. Увеличение сроков воздействия до 84 сут привело к усилению продукции МДА и, следовательно, к активизации ПОЛ. Так, на фоне SiO2 НЧ концентрация МДА при дозе 10 мг/дм3 превысила контрольные значения в 11 раз, при 100 мг/дм3 — в 12 раз. Аналогичные результаты получены при оценке действия наночастиц кремния на карася (23).

Присутствие наночастиц в корме и в воде повлияло на активность ферментов антиоксидантной защиты (СОД и КТ) у тест-объекта. По СОД у Danio rerio на 7-е сут во всех опытных группах показатель был меньше контроля. Так, в варианте с CeO₂ НЧ он снизился на 75 % при дозе нанопрепарата 10 мг/дм³ и на 69 % — при 100 мг/дм³, на фоне SiO₂ НЧ — на 50 и 26 % соответственно при дозе 10 и 100 мг/дм³. На 14-е сут активность СОД в присутствии наночастиц различалась в зависимости от их вида. CeO₂ НЧ вызывали снижение значений по СОД: для 10 мг/дм³ — на 41 %, для 100 мг/дм³ — на 29 % (табл. 2). При добавлении SiO₂ НЧ к корму показатели для СОД превышали таковые в контрольных образцах только на 20-е сут (в 1,96 раза при дозе 10 мг/дм³ и в 1,48 раза — при 100 мг/дм³).

2. Активность каталазы (КТ) и супероксиддисмутазы (СОД) в гомогенатах Danio rerio в зависимости от доз и времени воздействия наночастиц (НЧ) CeO₂ и SiO 2 ( M ± m , n = 75)

Нанопрепарат	КТ, мкмоль/л	СОД, % ингибирования адреналина
	доза 10 мг/дм3  доза 100 мг/дм3	доза 10 мг/дм3   доза 100 мг/дм3
CeO 2 НЧ SiO 2 НЧ	Н а 7-е сут 93,1±0,7 ∗              51,4±0,5 ∗∗ 15,9±0,4            46,9±1,0 ∗	17,6±2,8 ∗             48,5±1,7 ∗ 35,6±1,2 ∗∗             52,4±2,6 ∗
Контроль                           16,4±0,5                               70,6±0,5 Н а 14-е сут CeO 2 НЧ                  97,4±2,1 ∗∗           83,3±2,9 ∗             28,1±1,5            33,7±1,1 SiO 2 НЧ                    77,1±2,8 ∗∗            29,3±1,4              93,6±3,7 ∗             70,6±2,1 ∗ Контроль                           16,2±0,3                               47,6±0,6 Н а 84-е сут SiO 2 НЧ                     15,9±0,9 ∗             20,2±1,1              6,1±0,2 ∗∗              10,8±1,1 ∗ Контроль                           23,1±0,8                                59,3±1,8 ∗ , ∗∗ Различия с контролем статистически значимы соответственно при Р < 0,05 и Р < 0,01.

Значительное снижение активности СОД к окончанию экспери- мента вполне ожидаемо и определяется развитием токсических реакций, сходных с описанными ранее в присутствии ксенобиотиков и кадмия (27).

Похожую динамика мы наблюдали и для каталазы (см. табл. 2).

Рис. 2. Содержание кремния в тканых Danio rerio в зависимости от времени воздействия наночастиц SiO2 (100 мг/дм3 воды): а — контроль, б — опыт.

^{∗ , ∗∗} Различия с контролем статистически значимы соответственно при Р < 0,05 и Р < 0,01.

Таким образом, полученные нами результаты показывают, что на начальных этапах воздействия НЧ на организм происходит заметное снижение функции систем защиты клетки от окислительного стресса. Возможно, это следствие способности НЧ выступать в качестве аналога каталазы и проявлять активность, до некоторой степени сходную с действием СОД (28). Характерно, что активность КТ и СОД, которая изменяется в присутствия CeO2 НЧ и SiO2 НЧ, со временем восстанавливается (29). Поэтому мы полагаем закономерным, что динамика показателей по СОД и КТ у Danio rerio под влиянием наночастиц противоположна описанной ранее для токсических веществ — например, инсектицида имидаклоприда, действие которого выражалось сначала в увеличении активности КТ и СОД, а затем в ее значительном снижении (30).

В этой связи сложно объяснить гибель Danio rerio в эксперименте. Причина могла быть в том, что ультрадисперсная природа частиц оксидов способна привести к их накоплению в тканях у рыб. Это ранее показано в ряде исследований (24, 27, 30). В наших экспериментах подобный факт также имел место, особенно в первые недели, что хорошо видно на примере кремния (рис. 2). Однако в дальнейшем содержание кремния в организме Danio rerio снизилось, вероятно, вследствие работы системы гомеостаза (25). При этом SiO₂ НЧ не препятствуют регенерации тканей (23), но способны вызывать как протромботические эффекты, так и увеличения концентрации фибриногена, а также провоспалительных цитокинов в плазме (22, 31). При этом маркеры окислительного стресса (СОД, КТ) остаются не затронутыми (22). Интересное объяснение гибели тестового организма при контакте с НЧ дают S.N. Petrache с соавт. (26), связывая ее с воздействием СеО₂ на кишечную палочку, которое сопровождается снижением потребления корма и последующими изменениями в обмене веществ (32). Аналогичные данные приводятся в работе M.C. Arnold с соавт. (33).

Итак, исследованные наночастицы (НЧ) обладают токсическим эффектом, поскольку их поступление в организм Danio rerio (биоиндикатор) сопровождается полной (CeO2 НЧ) или частичной (SiO2 НЧ) гибелью тест-объекта к окончанию эксперимента. В начальный период воздействия отмечается депрессия антиоксидантной системы, но к концу 2-й нед появляются признаки адаптации. Содержание малонового диальдегида при дозе SiO₂ НЧ 10 мг/дм³ увеличивается в 11 раз, 100 мг/дм³ — в 12 раз, для CeO₂ НЧ отмечены похожие изменения.