О возможности применения программы Adobe Photoshop для морфометрического анализа цифровых изображений микропрепаратов при проведении иммуногистохимического исследования костного матрикса

Введение. В настоящее время все проводимые исследования в области как экспериментальной, так и клинической медицины требуют объективной оценки полученных результатов [1]. Не являются исключением и многочисленные работы, посвященные изучению проблем репаративной регенерации клеток, тканей и органов, в том числе и посттравматической регенерации костной ткани [2, 3]. В связи с чем, возникла необходимость в объективной количественной оценке процесса заживления переломов костей в условиях эксперимента. Одной из характеристик, отражающих состояние репаративного процесса костной ткани является оценка содержания белков костного матрикса в гистологических срезах. Все известные в настоящее время методы оценки содержания структур в гистологических срезах основаны на принципах и методах системной морфометрии и стереологии, основополагающими из которых являются способы определения относительной объёмной плотности тканевых микроструктур: 1) метод наложения точечных сеток (метод «полей» А.А. Глаголева) и 2) метод суммирования линий сканирования [4]. Недостатками вышеперечисленных способов является наличие многочисленных, зачастую трудновыполнимых условий для получения объективных данных: необходимость многократных измерений, трудоёмкость применения окулярной точечной сетки, окулярной тестовой линии сканирования или аналогичных измерительных сеток и линий, но адаптированных для микрофотографий, «ручной» подсчёт элементов, большие затраты времени, большая погрешность измерений из-за размытости границ гистохимической окраски структур и субъективной оценки свето- и цветовосприятия, что в совокупности усложняет использование этого метода для решения крупных научных задач. Несмотря на то, что в настоящее время на рынке предлагаются аппаратно-программные комплексы для морфометрии, которые пригодны для объективной оценки содержания биоструктур в гистологических препаратах [5-8], все они не лишены главного их недостатка – дороговизны, что значительно ограничивает их широкое распространение и практическое применение. Для устранения недостатков выше описанных способов при определении относительной объёмной плотности (ООП) белков костного матрикса на разных сроках остеорепа-ративного процесса предлагается метод, основанный на анализе цифровых микрофотографий иммуногистохимических препаратов при помощи программы Adobe Photoshop Extended.

Цель исследования – расширение арсенала способов и повышение точности сравнительной оценки содержания белков костного матрикса на разных сроках остеорепаративного процесса.

Материал и методы исследования. Экспериментальное исследование проведено на 70 половозрелых крысах самцах линии «Вистар». Все исследования на животных были выполнены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ Минвуза СССР от 13.11.1984 г. № 724). Животным под ингаляционным наркозом формировали открытый поперечный перелом средней трети диафиза левой большеберцовой кости. В опытной группе (ОГ) животным в область перелома на 1 и 2 сутки эксперимента вводили по 0,5 мл препарата «Винфар», содержащего метаболиты культуры Bacillus subtillis 804 [9], в контрольной группе (КГ) – 0,5 мл физ. раствора. Осуществлена естественная иммобилизация посредством сохранившей целостность малоберцовой кости. Животных выводили из опыта на 3, 21, 44 и 61 сутки. Исследования проводили с использованием иммуногистохимических методов и морфометрии. При проведении иммуногистохимических методов исследования для выявления экспрессии Osteocalcin (маркер созревания костной ткани), collagen II (маркер хондрогенеза) и collagen I (в нашем исследовании – маркер остеогенеза) использовались соответственно антитела anti-Osteocalcine («SPRING Bioscience», США), antiCollagene II Type и anti-Collagene I Type («GeneTex», США). Используемая система детекции - Reveal Polyvalent HRP – DAB Detection System («SPRING Bioscience», США). Далее делали цифровые микрофотографии зоны периостальной и эндостальной костной мозоли, которые загружали в компьютерную программу Adobe Photoshop CS6 Extended с последующим выделением и вычислением в исследуемом цифровом изображении площади участков иммуногистохимически окрашенных структур, содержащих определяемые белки (остеокальцин, коллаген I или коллаген II) в относительных значениях (вычисление относительной объемной плотности - ООП), в пределах исследуемого гистосреза на 1 цифровой микрофотографии (равной 1 полю зрения) при увеличении х300 минимум в 5 полях зрения (микрофотографий) для каждого показателя. Для этого цифровой фотоснимок загружали в программу Adobe Photoshop CS6 Extended (подходят и более ранние CS3, CS4, CS5 версии программы) и в левой колонке панели инструментов выбирали инструмент «Волшебная палочка», после чего кликали по вкладке главного меню «Выделение», и в открывшемся меню выбирали «Цветовой диапазон» – инструмент обеспечивающий выбор области в изображении по тональности или цвету. Далее в открывшемся диалоговом окне инструментом «Пипетка» в области цифровой микрофотографии выбирали участок нужного цвета и тональности, соответствующий цвету и тональности преципитирующего специфического хромогена соответствующей системы детекции применяемой в ходе иммуногистохимического окрашивания гистологического препарата. После выбора «Пипеткой» нужного цвета на всей площади цифровой микрофотографии автоматически выделялись области подобного цвета и тональности. Далее границы выделенных областей расширяли или сокращали в зависимости от избыточности или недостаточности включения в области выделения пикселей тех оттенков и тональностей цвета, что соответствуют цвету шаблона используемой системы детекции. Для этого в правой стороне диалогового окна «Цветовой диапазон» выбирали пипетку со знаком «+» или «-», а также использовали опцию «Разброс» для установки приемлемого диапазона яркости выделяемых пикселей, от настройки параметров которой так же будут зависеть границы выделяемой области. После необходимой коррекции по яркости включаемых в область выделения пикселей формируются окончательные, уточнённые путем настройки выше описанных параметров, границы выделенных областей цифровой микрофотографии, суммарная относительная площадь которой и будет соответствовать относительной объёмной плотности белков внеклеточного матрикса проявивших себя в цифровом изображении окраской соответствующей цвету специфического хромогена (в нашей работе хромоген DAB образует темно-коричневые преципитаты). Для того чтобы при анализе следующего цифрового изображения гистологических препаратов той же ткани, окрашенной теми же иммуногистохимическими реактивами не повторять коррекцию границ областей выделения и нивелировать субъективность (а значит и возможные ошибки) при каждой такой коррекции, мы сохраняли шаблон настроенных параметров инструмента уже откорректированных границ. Далее во вкладке главного меню «Окно» выбирали строку «Журнал измерений» и открывшемся диалоговом окне кликали на опцию «Записать измерения» после чего автоматически формировалась таблица с различными рассчитанными параметрами выделенных областей изображения. Числовое значение первой строки «Измерение 1» в столбце «Площадь» соответствовало суммарной площади всех выде- ленных областей в анализируемом изображении, содержащих исследуемый белок (Sa). Единицей измерения по умолчанию является пиксел. Общая площадь цифрового изображения (St) зависит от разрешения микрофотографии, соответствует произведению значений строки «Измерение 1» в столбцах «Высота» и «Ширина» и всегда одинакова при условии одинакового разрешения всех анализируемых цифровых изображений, что значительно упрощает вычисление ООП по следующей формуле: ООП (%)=(Sa/St)×100. При проведении статистической обработки результатов вычисляли средние значения абсолютных и относительных величин (M), ошибки средних величин (m) и t-критерий Стьюдента. Различия средних величин считали достоверными при уровне значимости р <0,05.

Результаты исследования и их обсуждения. На 3 сутки у животных контрольной группы (КГ) в периостальной зоне перелома синтез остеокальцина незначителен и составляет 0,218±0,009%, тогда как в опытной группе (ОГ) ООП остеокальцина в 2 раза выше – 0,423±0,013% (рис. 1А). Экспрессия коллагена I типа в ОГ (ООП 9,40±0,62%) больше таковой группы контроля (ООП 3,92±0,31%) почти в 3 раза (рис. 2А). У животных контрольной группы ООП коллагена II типа составляет 4,77±0,11%, что незначительно превышает данный показатель в ОГ (ООП коллагена II типа 4,03±0,08%) (рис. 3А). В эндостальной костной мозоли на 3 сутки эксперимента содержание остеокальцина в ОГ вдвое больше КГ и незначительно превышает аналогичные показатели периостальной зоны (ООП остеокальцина КГ 0,293±0,011% и ООП остеокальцина КГ 0,579±0,013%) (рис. 1Б). ООП коллагена I типа в эндостальной мозоли в обеих группах троекратно (рис. 2Б), а ООП коллагена II типа – четырехкратно меньше, чем в периостальной мозоли (рис. 3Б). На 21 сутки у животных КГ в периостальной зоне перелома ООП экспрессия коллагена I типа в ОГ (ООП 20,7±1,01%) на этом сроке возрастает и, по-прежнему, больше таковой группы контроля (ООП 11,25±1,12%). У животных контрольной группы ООП коллагена II типа составляет 19,16±0,98%, в ОГ ООП коллагена II типа – 12,55±0,52%. В эндостальной костной мозоли на 21 сутки эксперимента содержание остеокальцина в КГ (ООП 0,747±0,008%) незначительно превышает ОГ (ООП 0,621±0,013%). На 44 сутки у животных КГ в периостальной зоне перелома ООП остеокальцина составляет 1,156±0,034%, а в ОГ ООП остеокальцина уже на данном сроке достигает значений (ООП 1,582±0,026%) близких с ООП нормальной (около 1,6%) костной ткани [10]. Экспрессия коллагена I типа в ОГ (ООП 42,43±2,21%) на этом сроке двукратно возрастает и, по-прежнему,

Рис. 1. Относительная объемная плотность (ООП) остеокальцина на разных сроках заживления перелома кости: А) ООП остеокальцина в периостальной мозоли, Б) ООП остеокальцина в эндостальной мозоли.

Рис. 2. Относительная объемная плотность (ООП) коллагена I типа на разных сроках заживления перелома кости: А) ООП коллагена I типа в периостальной мозоли, Б) ООП коллагена I типа в эндостальной мозоли.

Рис. 3. Относительная объемная плотность (ООП) коллагена II типа на разных сроках заживления перелома кости: А) ООП коллагена II типа в периостальной мозоли, Б) ООП коллагена II типа в эндостальной мозоли.

двукратно больше таковой группы контроля (ООП 21,23±1,94%). У животных контрольной группы ООП коллагена II типа составляет 9,35±0,97%, в ОГ ООП коллагена II типа – 4,33±0,82%, т.е. происходит уменьшение экспрессии коллагена II в обеих группах по сравнению с предыдущим сроком, из-за остеогенной реорганизацией периостальной мозоли, что так же подтверждается увеличением ООП коллагена I типа, см. выше. В эндостальной костной мозоли на 44 сутки эксперимента содержание остеокальцина продолжает уменьшаться в обеих группах животных, и, по-прежнему, в КГ ООП (0,460±0,017%) двукратно превышает ООП остеокальцина ОГ (0,242±0,028%) из-за более выраженной редукции эндостальной мозоли в ОГ по сравнению с контролем. ООП коллагена I типа эндостальной мозоли в КГ все еще увеличивается – 12,2±0,49%, тогда как в ОГ уменьшается – 8,75±0,53%, подтверждая развитие эндостальной мозоли в КГ и продолжение процесса её редукции в ОГ на данном сроке эксперимента. ООП коллагена II типа КГ – 6,04±0,12%, в ОГ – 2,97±0,47%. На 61 сутки экспрессия коллагена I типа в ОГ (ООП 69,25±2,23%) возрастает более чем на треть и на треть больше таковой группы контроля (ООП 46,09±1,74%), на данном сроке достигая значений близких с ООП коллагена I нормальной (около 70,0%) костной ткани [10]. ООП коллагена I типа эндостальной мозоли в КГ начинает уменьшаться только на 61 сутки – 8,87±0,05%, подтверждая начавшийся процесс редукции эндостальной мозоли, тогда как в ОГ ООП коллагена I типа составляет 8,01±0,02%, достигая значений близких с ООП коллагена I нормальной костной ткани (около 7,0-8,0%). ООП коллагена II типа эндостальной мозоли в КГ – 2,9±0,03%, в ОГ – 1,09±0,02%.

Заключение. Таким образом, определение ООП коллагеновых и неколлагеновых белков эндостальной и периостальной мозолей по формуле: ООП (%) = (Sa / St) ×100, при автоматическом выделении и вычислении с помощью программы Adobe Photoshop Extended в цифровых изображениях площадей участков структур, содержащих исследуемые белки, позволяет объективно определить динамику заживления открытого перелома кости в эксперименте, что в примере конкретного использования подтверждается более ранними сроками консолидации перелома диафиза большеберцовой кости в опытной группе животных при применении препарата «Винфар», в результате проявленного ангиогенного воздействия входящего в его состав метаболитов культуры Bacillus subtillis 804, а также влияния на пролиферативную активность клеток хондрогенного и остеогенного дифферонов, ответственных за синтез соответствующих белков костного матрикса.