Об особенностях селекции фиолетовозерной пшеницы на основе сортов с антоциановой окраской колеоптиля и стебля

Антоцианы — водорастворимые растительные пигменты, которые положительно влияют на здоровье человека благодаря антиоксидантным, противовоспалительным, гипогликемическим, антимутагенным, антидиабе-

^∗ Выращивание растений в тепличном комплексе ЦКП «Ливр» было поддержано бюджетным проектом ИЦиГ СО РАН ¹ FWNR-2022-0017. Исследование выполнено при поддержке Российского научного фонда, грант ¹ 21-66-00012.

тическим, противораковым и нейропротекторным свойствам (1-4). Природные антоцианы представляют интерес для производства функциональных продуктов питания, пищевых красителей, так называемой умной упаковки (5). В зависимости от структуры молекулы и рН среды цвет этих пигментов может варьироваться от красного и пурпурного до синего. Антоцианы накапливаются в вегетативных и генеративных органах растений, выполняя защитные функции при биотических и абиотических стрессах (6, 7). Адаптационные свойства этих природных соединений связаны в первую очередь с их высокой антиоксидантной активностью благодаря наличию реакционноактивных гидроксильных групп и способности участвовать в метилировании, метаксилировании, алкилировании, гликозилировании и хелатировании металлов переменной валентности (Fe, Zn, Mn, Cu) (8).

У пшеницы и других злаков антоцианы накапливаются в оболочках зерна, что делает его перспективным сырьем с повышенными потребительскими качествами (9-11). Богатая антоцианами фиолетовозерная пшеница обещает стать функциональным пищевым продуктом — источником простых и сложных фенольных соединений, белков, углеводов, пищевых волокон, витаминов группы В и макро- и микроэлементов (12, 13). Зерно такой пшеницы имеет сложный антоциановый профиль, содержащий около 22 различных соединений (10). Доминирующий антоциановый пигмент — ци-анидин-3-глюкозид (Сy-3-glu), на его долю приходится 19,3-30,5 % от общего количества антоцианов в зерне (14). Кроме антоцианов, у фиолетовозерных сортов пшеницы достоверно повышено содержание фенольных кислот и флавонола кверцетина, обладающих выраженными антиоксидантными свойствами и противовоспалительным действием (12, 15, 16). Уже проводится технологическая оценка потенциала фиолетовозерной пшеницы для производства таких функциональных продуктов питания, как цельнозерновой хлеб, печенье с отрубями (10, 13, 17).

Получение форм зерновых культур с измененным содержанием антоцианов — одно из быстро развивающихся направлений в современной селекции, что требует эффективных протоколов, основанных на знаниях о генетическом контроле биосинтеза этих соединений. Ключевые гены Рр ( Purple pericarp, Pp-1 / Myb и Рр3 / TaMyc1 ), регулирующие биосинтез антоцианов в перикарпе зерновки мягкой пшеницы ( Triticum aestivum L., 2 n = 42, BBAADD ) , были картированы в геноме соответственно в коротких плечах хромосом 7-й гомеологической группы (гены Pp-А1 , Pp-В1 , Pp-D1 ) и в длинном плече хромосомы 2A (18, 19). Гомеологичные гены Pp-1 (= Rc-1 , Red coleoptile ) кодируют регуляторный фактор R2R3-Myb типа, активируют биосинтез антоцианов не только в перикарпе зерновки, но также в колеоптиле и в стебле (20). Наличие трех гомеологичных генов Pp-1 в рецессивном состоянии определяет неокрашенный фенотип растения. Если хотя бы один из этих генов находится в доминантном состоянии, в вегетативных органах пшеницы будут синтезироваться антоциановые пигменты, а при наличии доминантного аллеля гена Pp3 антоцианы будут синтезироваться и в зерне (21). Доминантный аллель гена Рр3 , определяющий синтез антоцианов в перикарпе зерновки, является уникальным. Он имеет эндемичное происхождение от тетраплоидного вида пшеницы — T. aethiopicum [синоним T. turgidum subsp . durum (Desf.) Husn . ] и перенесен в геном мягкой пшеницы методом классической гибридизации и отбора (22). В отличие от гена Рр3 доминантные аллели генов Pp-1 широко представлены у диплоидных, тет-раплоидных и гексаплоидных видов пшениц (20, 23, 24). Между образцами пшеницы имеются существенные различия в содержании антоцианов в колеоптиле, что может быть обусловлено различными аллелями генов Pp-1 508

(18). Ранее были созданы почти-изогенные фиолетовозерные линии мягкой пшеницы на основе скрещивания и многократных беккроссов сорта Саратовская 29 и беккроссные фиолетовозерные гибридные линии, наследующие доминантные аллели генов Pp-D1 и Рр3 от сортов Purple и Purple Feed (25, 26).

Цель работы заключалась в создании фиолетовозерных гибридов с новыми доминантными аллелями гена Рр-D1, привнесенными из разных сортов, и в сравнительном изучении влияния этих новых аллелей на биосинтез антоцианов в вегетативных и генеративных тканях растений (в колеоптилях и в перикарпе зерновок). Для доказательства наличия у сортов с антоциановой окраской колеоптилей доминантных аллелей гена Pp-D1 , необходимого для создания фиолетовозерных гибридов пшеницы, мы скрестили растения этих сортов с неокрашенными почти-изогенными линиями пшеницы в качестве доноров доминантного аллеля гена Pp3, провели отбор и оценку полученных гибридов.

Методика . Растительный материал. В качестве материнских форм при создании гибридов с новыми аллелями гена Рр-1 отобрали три образца мягкой пшеницы ( Triticum aestivum L.) с фиолетовой окраской колеоптиля и верхнего междоузлия стебля: сорт Сибирская 21, сорт Терция, линия Эритроспермум 4-16 (зарегистрирована в 2024 году как сорт Агрономическая 5, код 7953809) и образцы с зелеными стеблями: линия Лютесценс 5315, сорт Столыпинская 2, сорт Силантий (коллекция ОмГАУ, г. Омск). В качестве отцовских форм использовали почти-изогенные линии i:S29 Рр3 ^P pp-A1 ^YP (= С29 Рр3 ^P) и i:S29 Рр3 ^PF pp-A1 ^YP (= С29 Рр3 ^PF), созданные на основе сорта Саратовская 29 (коллекция ИЦиГ СО РАН, г. Новосибирск). Эти линии не имеют антоциановой окраски вегетативных органов и зерна, но несут доминантный аллель гена Pp3 в составе небольших рекомбинантных участков хромосом 2А соответственно от сортов Purple (k-46990, Австралия) и Purple Feed (k-49426, Канада) (коллекция ВИР). Отсутствие окраски вегетативных органов у этих линий обусловлено присутствием рецессивных аллелей генов Pp-B1 и Pp-D1 сорта Саратовская 29 и замещением слабого доминантного аллеля гена Pp-A1 этого сорта рецессивным аллелем гена от сорта Yanezkis Probat (YP) (25) .

В сравнительных исследованиях в качестве контрольных использовали ранее созданные почти-изогенные фиолетовозерные линии i:S29 Рр3Pp-D1 ^P (=фC29^P) и i:S29 Рр3Pp-D1 ^PF (=фC29^PF), i:S29 Pp3 ^P Pp-D1 ^PF (=фC29^PPF), бек-кроссные гибридные линии BC 1 F 4 (Эл 22*2/i:S29 Pp3Pp-D1 ^PF) (=фЭл 22^PF), BC 1 F 4 (STRU*2/i:S29 Pp3Pp-D1 ^PF) (=фSTRU^PF), BC 1 F 4 (BW49880*2/i:S29 Pp3Pp-D1 ^P) (=фBW49880^P) и их родительские линии и сорта (20, 26).

Схема скрещивания. Для получения фиолетовозерных гибридов растения выращивали в гидропонной теплице в грунте из керамзита при 2-разовом поливе питательным раствором Кнопа Центра искусственного выращивания растений ИЦиГ СО РАН (г. Новосибирск) при 16-часовом освещении лампами дневного света и дневной/ночной температуре воздуха от 18/20 ° С до 22/24 ° С. Незрелые пыльники у реципиентных сортов удаляли и проводили опыление пыльцой, собранной с цветков донорных растений. Гибридные растения поколения F 1 самоопылялись, в результате чего были получены семена F 2.

В поколении F2 (40 растений каждой гибридной комбинации) проводили двухступенчатый отбор гомозиготных растений по целевым генам с помощью молекулярного анализа: 1) с использованием внутригенного маркера Pp3-diagnostic (27) — по наличию продуктов ПЦР-амплификации внутригенной последовательности ДНК, соответствующих по длине доминантному аллелю гена Pp3, 2) по наличию ПЦР-продуктов, подтверждающих присутствие SSR-локусов Xgwm0044 и Xgwm0111, сцепленных с геном Pp-D1. Отобранные нами фиолетовозерные растения послужили источником новых линий пшеницы. Зерна с отдельных растений фиолетовозерных гибридов F2 были высажены и самоопылялись для получения линий F3. Методом индивидуального отбора семена двух линий поколения F4 высевали для оценки их продуктивности в полевых условиях.

Выделение ДНК . ДНК экстрагировали из листьев каждого растения поколения F 2 от каждого скрещивания и из растений родительских линий в соответствии с процедурой модифицированного протокола J. Plaschke с соавт. (28). Около 100 мг свежей зеленой массы (листья 2-3-недельных проростков) помещали в пробирку объемом 1,5 мл, добавляли 200 мкл буфера для экстракции (100 мМ Трис-HCl, рН 7,5; 500 мМ NaCl, 50 мМ EDTA, 1,25 % SDS, 3,8 % Na 2 S 2 O 5 ) и измельчали с помощью гомогенизатора. Добавляли ещe 500 мкл буфера для экстракции, инкубировали на водяной бане при 60 ° С 30 мин. Добавляли 700 мкл смеси хлороформ:изоами-ловый спирт (24:1), перемешивали и центрифугировали в течение 15 мин при 12000 об/мин. ДНК осаждали, добавляя к водной фазе 1,4 мл 96 % охлажденного этанола ( - 20 ° С), центрифугировали 10 мин при 12000 об/мин. Осадок высушивали на воздухе и растворяли в 50 мкл буфера ТЕ (10 мМ Трис-НСl, рН 8,0; 1 мМ EDTA). Для оценки качества и количества экстрагированной ДНК применяли аналитический электрофорез, после чего для стандартизации количества ДНК до 100 мкг/мкл пробы разводили стерильной бидистиллированной водой.

Молекулярные маркеры. Для точного молекулярного анализа ДНК изучаемых растений использовали сконструированный нами внутри-генный полиморфный маркер Рр3-diagnostic, позволяющий отличать доминантные аллели гена Рр3 от рецессивных (27). В работе также использовали микросателлитные маркеры GWM (Gatersleben Wheat Marker) (29), фланкирующие локус гена Pp-1D на хромосоме 7D (Xgwm0044 и Xgwm0111).

Полимеразная цепная реакция. ПЦР проводили в реакционной смеси объемом 20 мкл. На 100 нг ДНК-матрицы — выделенной из листьев ДНК (1 мкл) приходилось 67 мM Трис-НСl (рН 8,8), 1,8 мM МgCl2, 0,01 % Tween 20, 18 мM (NH4)2SO4, по 0,2 мM каждого дНТФ, по 0,3 мкМ прямого и обратного специфичных праймеров (ООО «Биоссет», г. Новосибирск, , 1 ед. Taq-ДНК-полимеразы TAQ-02 (ООО «Биоспецифика», г. Новосибирск, . Амплификацию проводили в T100 Thermal Cycler («Bio-Rad», США) по общепринятой методике: преденатурация — 2 мин при 94 °С; 45 циклов: денатурация — 1 мин при 94 °С, отжиг матрицы с праймерами — 1 мин при соответствующих праймерам температурах, полимеризация — 2 мин при 72 °С; достраивание ПЦР-фрагментов — 5 мин при 72 °С. В режиме TOCHDOWN проводили преденатурацию в течение 2 мин при 94 °С; далее 13 циклов: денатурация — 15 с при 94 °С, отжиг матрицы с праймерами — 30 с при 65 °С с понижением на 0,7 °С/цикл, полимеризация — 45 с при 72 °С), затем 24 цикла: денатурация — 15 с при 94 °С, отжиг матрицы с праймерами — 30 с при 56 °С, полимеризация — 30 с при 72 °С; стандартная финальная элонгация — 5 мин при 72 °С.

Продукты ПЦР разделяли в 2 % агарозном геле (LE Agarose, «Lonza Rockland, Inc.», США) и 5 % агарозном геле высокого разрешения (HR, high resolution) HyAgarose™ HR Agarose («ACTGene, Inc.», США), приготовленных на ТАЕ-буфере (40 мМ Трис-НСl, pH 8,0, 20 мМ ацетат натрия, 1 мМ EDTA) с добавлением бромистого этидия. В карманы геля наносили по 10510

20 мкл реакционной смеси с продуктами ПЦР с добавлением 5 % глицерина, 0,05 % бромфенолового синего и 0,05 % ксиленцианола. Использовали маркер длины фрагментов ДНК 100 bp (ООО «Биолабмикс», г. Новосибирск, . Электрофорез проводили в горизонтальной камере в течение 1-5 ч при напряжении 7 B/см. Для получения изображений гелей в УФ-свете, их документирования и анализа использовали систему Molecular Imager® Gel DocTM XR+ System («Bio-Rad Laboratories, Inc.», США).

Выделение и оценка суммарного содержания антоцианов (ССА). Из зрелых зерновок антоцианы экстрагировали после измельчения образцов в мельнице ЛЗМ-1 (ООО «СовЛаТ», Россия). Для выделения антоцианов из колеоптилей семена проращивали на влажной фильтровальной бумаге в климатической камере RUMED® («RUBARTH APPARATE GmbH», Германия) при 20 ° С и 12-часовом фотопериоде, колеоптили растирали. Антоцианы экстрагировали 1 % HCl в метаноле согласно описанию (30) в 3 биологических повторностях для каждой линии. Для каждой повторности отбирали по 0,2 г растертой ткани и добавляли по 1 мл 1 % раствора HCl в метаноле. Суспензии оставляли на ночь при +4 ° С, после чего центрифугировали (30 мин, 12000 об/мин, +4 ° С). Количество антоцианов в супернатанте оценивали по поглощению при длине волны 530 и 700 нм (спектрофотометр SmartSpec^TM Plus («Bio-Rad Laboratories, Inc.», США). Скорректированное значение А 530 - А 700 использовали для расчета массовой концентрации по эквиваленту самого распространенного в зерновке антоцианидина цианидин-3-глюкозида (Cy-3-Glu) (мкг/г сухой массы образца) в соответствии с описанием (31).

Полевая оценка продуктивности растений. Для учета показателей продуктивности растений гибридные линии выращивали рядами длиной 1 м на опытном участке селекционно-генетического комплекса ИЦиГ СО РАН (г. Новосибирск, 54.847102N, 83.127422Е, 2021 год). У 10 растений каждого генотипа измеряли высоту, длину главного колоса, определяли продуктивную кустистость (число продуктивных колосьев на растении), учитывали число колосков в главном колосе, число и массу зерен с главного колоса, число и массу зерен с растения, массу 1000 зерен.

Методы статистического и компьютерного анализа. Значения ССА и показатели урожайности представлены в работе в виде среднего ( М ) и стандартного отклонения (±SD). Статистический анализ проводили в программе Statistica v. 6.1 («StatSoft, Inc.», США). Статистическую достоверность различий между средними значениями оценивали с помощью критериев Манна-Уитни и Стьюдента-Ньюмена-Кейлса для попарных множественных сравнений независимых групп (32). При p < 0,05 различия считали статистически значимыми. Взаимосвязь между ССА в колеоптиле и в зерне оценивали с помощью коэффициентов ранговой корреляции Спирмена.

Результаты . Фенотипическая и генетическая характеристика донорных, реципиентных и контрольных линий и сортов, использованных в работе, представлена в таблице 1.

1. Линии и сорта пшеницы ( Triticum aestivum L.), использованные в работе

Линия/сорт

Сокращенное обозначение	Pp3	Окраска
		колеоптиля/ Pp-1 зерна

Оригинатор (ссылка)

Реципиенты

Лютесценс 53-15

Силантий

Столыпинская 2

с р ец е с с ив ны м и алл елям и ге но в Pp-1

Лют 53-15	-	-	-	ОмГАУ
Силантий	-	-	-	ОмГАУ
Стол 2	-	-	-	ОмГАУ

Продолжение таблицы 1

Реципиенты	с доминатными		аллелями генов		Pp-1
Сибирская 21	Сиб 21	-	+/ Pp-D1	-	СибНИИРС, 2019
Терция	Терция	-	+/ Pp-D1	-	Курганский НИИСХ, ОмГАУ, ИЦиГ СО РАН
Эритроспермум 4-16 (Агронимическая 5) Эр 4-16		-	+/ Pp-D1	-	ОмГАУ
Доноры	доминантных	ал	л ел е й г е н ов Pp3
i:S29 Рр3 P pp-A1 YP	С29 Рр3 P	+	-	-	ИЦиГ СО РАН (21)
i:S29 Рр3 PF pp-A1 YP	С29 Рр3 PF Контрольные	+ об	разцы	-	ИЦиГ СО РАН (21)
i:S29 Рр3Pp-D1 P	фС29 P	+	+/ Pp-A1 , Pp-D1	+	ИЦиГ СО РАН (21)
i:S29 Рр3Pp-D1 PF	фС29PF	+	+/ Pp-A1 , Pp-D1	+	ИЦиГ СО РАН (21)
i:S29 Pp3 P Pp-D1 PF	фС29РPF	+	+ / Pp-A1 , Pp-D1	+	ИЦиГ СО РАН (30)
Саратовская 29	С 29	-	+/ Pp-A1	-	НИИСХ Юго-Востока
Элемент 22	Эл 22	-	-	-	ОмГАУ
STRU 0732-84k 071	STRU	-	-	-	Strube D&S GmbH, Германия
BW49880	BW	-	-	-	CIMMYT, INT, Мексика
BC 1 F 4 (Эл 22*2/i:S29 Pp3Pp-D1 PF)	фЭл 22 PF	+	+/ Pp-D1	+	ИЦиГ СО РАН (26)
BC 1 F 4 (STRU*2/i:S29 Pp3Pp-D1 PF)	фSTRUPF	+	+/ Pp-D1	+	ИЦиГ СО РАН (26)
BC 1 F 4 (BW49880*2/i:S29 Pp3Pp-D1 P)	фBW49880 P	+	+/ Pp-D1	+	ИЦиГ СО РАН (26)
Пр и м еч ани е. Наличие/отсутствие гена или признака —			соответственно +/ - .	Оригинаторы: ОмГАУ —
Омский государственный аграрный университет, СибНИИРС — Сибирский НИИ растениеводства, филиал

ИЦиГ СО РАН, г. Новосибирск, Курганский НИИСХ — Курганский НИИ сельского хозяйства, ИЦиГ СО РАН — Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск, НИИСХ Юго-Востока — Федеральный аграрный научный центр Юго-Востока, г. Саратов.

Рис. 1. Схема скрещивания и молекулярного отбора для получения фиолетовозерных гибридов пшениц с новыми доминантными аллелями гена Рр-Dl , регулирующего биосинтез антоцианов в колеоптиле и перикарпе зерновки.

Создание фиолетовозерных линий мягкой пшеницы. Схема скрещивания и молекулярного отбора для получения фиолетовозерных гибридов пшениц от сортов-реципиентов с антоциановой окраской колеоптилей и верхнего междоузлия стебля, несущих новые доминантные аллели гена Рр-D1 , с изогенными линиями — донорами доминантных аллелей гена Pp3 ^P и Pp3 ^PF от сортов Purple и Purple Feed представлена на рисунке 1.

Для получения фиолетовозерных линий на основе сортов Сиб 21, Терция и линии Эр 4-16, характеризующихся антоциановой ок- раской колеоптиля и стебля и, следовательно, несущих доминантные аллели генa Рр-1, эти образцы опылялись изогенными линиями С29Рр3P и С29Рр3PF — донорами доминантных аллелей Pp3, но не доминантных аллелей Pp-1. Полученные в результате скрещивания гибриды F1 были размножены до поколения F2.

Фиолетовозерные гибриды F 2 с доминантными аллелями сразу двух генов — Pp3 и Pp-D1 в гомозиготном состоянии выявляли с помощью ПЦР-детектирования. Для точного молекулярного анализа ДНК изучаемых растений использовали ДНК-маркеры, связанные с фиолетовозерно-стью (табл. 2).

2. ДНК-маркеры генов Pp3 и Pp-D1 , связанные с фиолетовозерностью, и режимы их ПЦР-амплификации

Маркер

Т, ° C

Размер ПЦР-продукта, п.н.

Маркируемая хромосома и ген

Пара праймеров 5 '^ 3 ' (ссылка)

Pp3-diagnostic TOCHDOWN	398/429	2A, Pp3	F: TAGTGCCGTCTAACTGGTGA R: ACGACGCCTAAGGAAACAC (27)
Xgwm0044        60	~ 175/173	7D, Pp-D1	F: GTTGAGCTTTTCAGTTCGGC R: ACTGGCATCCACTGAGCTG (29)
Xgwm0111        55	198	7D, Pp-D1	F: TCTGTAGGCTCTCTCCGACTG

R: ACCTGATCAGATCCCACTCG (29)

Используя внутригенный ДНК-маркер Pp3-diagnostic, позволяющий по длине ПЦР-продукта отличить доминантные аллели гена Рр3 от рецессивных (28), мы отобрали растения с доминантными аллелями гена Pp3 в гомозиготном состоянии, а с помощью SSR-маркеров Xgwm0044 и Xgwm0111 (29), сцепленных с геном Pp-D1 , — гомозиготные образцы по доминантному аллелю этого гена.

A

Ml 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

Рис. 2. Электрофореграммы продуктов ПЦР, полученных с использованием внутригенного маркера Pp3-diagnostic (А) и SSR-маркера Xgwm0111 (Б) , на ДНК родительских растений пшеницы линий Эритроспермум 4-16 (1), С29 Рр3 ^P (2) ( Triticum aestivum L.) и их гибридов поколения F 2 (324). Белыми стрелками отмечены гибриды, несущие в гомозиготном состоянии доминантный аллель гена Pp3 и аллель сцепленного с геном Рр-D1 маркера Xgwm0111, соответствующий реципиентному сорту. Розовыми стрелками отмечены двойные гомозиготы по этим маркерам. М — маркер молекулярных масс 100 bp (ООО «Биолабмикс», г. Новосибирск).

В качестве примера (рис. 2) приведены электрофореграммы ПЦР-продуктов после амплификации геномной ДНК родительских растений Эр 4-16, С29Рр3P и полученных в результате их скрещивания гибридов поколения F2. Среди проанализированных 22 гибридов (см. рис. 2) были выявлены два растения, несущих в гомозиготном состоянии доминантные аллели гена Pp3 от растения-донора и ПЦР-продукты SSR-маркера Xgwm0111, сцепленного с доминантным аллелем Pp-D1, унаследованные от реципиент-ного сорта. Из 40 гибридных растений таких образцов было только три. Аналогичным образом отобрали растения из комбинаций Эр 4-16 ½ С29Рр3PF, Терция ½ С29Рр3P, Терция ½ С29Рр3PF и Сиб 21 ½ С29Рр3P. У отобранных растений зерновки при созревании приобретали интенсивную фиолетовую окраску. В комбинациях скрещивания донорных линий С29Рр3P и С29Рр3PF с реципиентными сортами Лют 53-15, Стол 2 и Силантий, не накапливающими антоциановые пигменты в колеоптиле и стебле, мы отобрали растения, несущие в геноме доминантные аллели генов Pp3 от донорных линий совместно с аллелями SSR-маркеров, сцепленных с геном Pр-D1, соответствующих сортам-реципиентам. Несмотря на наличие доминантного аллеля гена Pp3, ни у одного из отобранных гибридных растений, которые получили от сортов с неокрашенными колеоптилями, зерновка не имела фиолетовой окраски.

Следовательно, для получения фиолетовозерных сортов пшениц с повышенным содержанием антоцианов в перикарпе зерновки достаточно при скрещивании растений пшеницы с антоциановой окраской колеоптиля и стебля, несущих доминантные аллели Рр-D1 ( Rc-D1 ), перенести в их геном только доминантные аллели Pp3 .

Суммарное содержание антоцианов в колеоптиле и зерне. ССА было оценено в колеоптиле 4-суточных проростков и в зрелом зерне в трех группах образцов (рис. 3). В первую группу отнесли гибриды, несущие доминантные аллели гена Pp3 доноров и рецессивные аллели гена Pp-D1 реципиентов, во вторую — отобранные окрашенные гибриды с доминантными аллелями гена Pp3 доноров и Pp-D1 реципиентов, в третью группу вошли контрольные образцы, содержащие доминантные аллели генов Pp3 и Pp-D1 , унаследованные либо от сорта Purple, либо от Purple Feed.

H 19.4s

»19,0“

№ 17,lbs

В 16,81'

Суммарное содержание антоцианов в колеоптила в пересчете на Cy-3-Glu, мкг/г

Рис. 3. Сравнение суммарного содержания антоцианов в колеоптилях 4-суточных проростков (слева) и в зрелых зерновках (справа) у гибридов F 2 , отобранных с помощью молекулярных маркеров, и у фиолетовозерных линий пшеницы, полученных ранее (в пересчете на цианидин-3-глюкозид, Су-3-glu) ( Triticum aestivum L., для каждого образца n = 3, M ±SD; гидропонная теплица, весенняя вегетация 2021 года, описание условий см. в разделе «Методика»). Одинаковыми буквами отмечены образцы, между которыми не выявили статистически значимых различий внутри групп, отмеченных фигурными скобками. Звездочками зеленого цвета отмечены образцы, у которых суммарное содержание антоцианов (ССА) в колеоптиле достоверно выше, чем в зерне, звездочками черного цвета — образцы, у которых ССА в зерне выше, чем в колеоптиле (при p < 0,05, U -test Манна-Уитни). Обозначения образцов см. в таблице 1.

В первой группе зерновки с отобранных гибридов F 2 , содержащих в геноме доминантные аллели Pp3 совместно с рецессивными аллелями pp-D1 от реципиентных сортов, не отличались друг от друга по содержанию соединений, поглощающих при длине волны λ = 530 нм, которая характерна для антоцианов. ССА в зерновках варьировало в пределах 2,1-2,8 мкг/г со средним значением 2,6 мкг/г и было достоверно ниже (p < 0,05, критерий Манна-Уитни), чем у сорта Саратовская 29 (3,9 мкг/г), несущего полудоминант-ный аллель Рp-A1 (см. рис. 3). ССА в колеоптиле у проростков из зерен с отобранных гибридов F 2 в этой группе варьировало в диапазоне 16,819,0 мкг/г со средним значением 18,3 мкг/г. За исключением гибрида из комбинации скрещивания Стол 2 ½ С29 Рр3 ^PF, ССА в зерне было достоверно ниже (p < 0,05), чем в колеоптиле у растений сорта Саратовская 29.

Во второй группе ССА в колеоптиле у проростков из зерен отобранных гибридных растений F 2 , несущих доминантные аллели Pp3 совместно с доминантными аллелями Pp-D1 от реципиентных образцов, варьировало от 35,4 мкг/г (Сиб 21 ½ С29 Рр3 ^P) до 69,0 мкг/г (Терция ½ С29 Рр3 ^P) (см. рис. 3). Среднее значение ССА в колеоптиле составило 47,4 мкг/г. ССА в колеоптилях гибридных проростков комбинаций Терция ½ С29 Рр3 ^PF и Терция ½ С29 Рр3 ^P было самым высоким в указанной группе гибридов и в проростках комбинации Терция ½ С29 Рр3 ^P достоверно (p < 0,05) отличалось от такового у гибридов с сортом Сибирская 21 и линией Эритроспермум 4-16. ССА в зерновках с отобранных гибридов поколения F 2 в этой группе варьировало от 34,1 мкг/г в комбинации Эр 4-16 ½ С29 Рр3 ^PF до 84,2 мкг/г в комбинации Эр 4-16 ½ С29 Рр3 ^P (см. рис. 3). Все гибриды из этой группы по ССА в зерне достоверно (p < 0,05) отличались от гибридов с наименьшим и наибольшим значениями ССА. Также достоверные различия по ССА в зерне были выявлены между отобранными гибридами из комбинаций скрещивания Сиб 21 ½ С29 Рр3 ^P и Терция ½ С29 Рр3 ^PF.

В третьей группе ССА в колеоптиле у проростков из зерен ранее полученных нами фиолетовозерных контрольных образцов пшеницы с доминантными аллелями генов Pp3 и Pp-D1 , унаследованными либо от сорта Purple, либо от Purple Feed, варьировало от 29,1 мкг/г у линии фSTRU^PF до 107,4 мкг/г у линии фЭл 22^PF (см. рис. 3). ССА в колеоптиле у всех образцов из этой группы достоверно (p < 0,05) превышало показатель линии фSTRU^PF с наименьшим значением ССА в колеоптиле. ССА в колеоптиле у линии фC29^P было достоверно (p < 0,05) ниже, чем у фЭл 22^PF.

Суммарное содержание антоцианов в зрелом зерне фиолетовозерных контрольных образов в этой группе варьировало от 40,1 мкг/г у линии фSTRUPF до 213,2 мкг/г у линии фBW49880P (см. рис. 3). Линия фSTRUPF имела наименьшее значение ССА (p < 0,05), линия фBW49880P — наибольшее значение этого показателя (p < 0,05). Кроме того, ССА в зернах почти-изогенной линии фC29P было выше (p < 0,05), чем у сестринской линии фC29PF и у линии фЭл 22PF.

При сравнении трех анализируемых групп по ССА было установлено, что количество антоцианов в колеоптиле и в зрелом зерне у неокрашенных образцов F 2 ниже (p < 0,05), чем у окрашенных гибридов F 2 , несущих доминантные аллели генов Pp-D1 от реципиентных сортов, и ниже, чем у полученных ранее фиолетовозерных линий. Достоверных различий между последними двумя группами фиолетовозерных образцов мы не выявили.

Мы также сравнили ССА в разных тканях растения — в колеоптиле и в зерне. У всех образцов из группы неокрашенных гибридов F 2 ССА в колеоптиле было выше (p < 0,05), чем в зерне. В группе гибридов

F 2 с антоциановой окраской зерна от скрещиваний Сиб 21 ½ С29 Рр3 ^P, Терция ½ С29 Рр3 ^PF и Эр 4-16 ½ С29 Рр3 ^P количество антоцианов в зерне превышало этот показатель в колеоптилях у проростков. У гибридов из комбинаций Терция ½ С29 Рр3 ^P и Эр 4-16 ½ С29 Рр3 ^PF не было различий по ССА между колеоптилем и зерном. В группе фиолетовозерных контрольных образцов у линий фSTRU^PF и фBW49880^P ССА в зерне было выше, чем в колеоптиле, тогда как у изогенной линии фC29^PF и линии фЭл 22^PF ССА в колеоптиле было выше, чем в зерне. В то же время у изогенной линии фC29^P ССА в зерне и колеоптиле не различалось.

Коэффициент корреляции между суммарным содержанием антоцианов в зерне и в колеоптиле составил r s = 0,83 (p = 0,0003, корреляция Спирмена).

Сравнительное изучение созданных фиолетовозерных линий. Два гибридных растения с наибольшим суммарным содержанием антоцианов в зерне (фТерция Рр3 ^P и фЭр4-16 Рр3 ^P), отобранных в комбинациях скрещивания Терция ½ С29 Рр3 ^P и Эр 4-16 ½ С29 Рр3 ^P, размножили до поколения F 4 , и полученные линии были протестированы по признакам продуктивности в полевых условиях 2021 года совместно с краснозерным сортом Саратовская 29, почти-изогенной линией фC29^PРF, белозерной селекционной линией BW49880 и созданной на ее основе фиолетовозерной линией фBW49880^P поколения BC 1 F 5 (табл. 3).

По всем изученным параметрам контрольная почти-изогенная линия фC29^PРF не отличалась от сорта Саратовская 29, на основе которого она была получена. Обе отобранные линии — F 4 Терция ½ С29 Рр3 ^P и F 4 Эр 4-16 ½ С29 Рр3 ^P не отличались от них по массе зерен с растения (соответственно 2,8 и 3,1 г). Гибридная линия F 4 от сорта Терция имела сниженное число зерен с растения, достоверно меньшее (p < 0,05), чем гибрид F 4 от линии Эритроспермум 4-16. По числу колосков в главном колосе (13,8 и 13,0) обе линии достоверно (p < 0,05) превосходили контрольные. Высота растения и масса 1000 зерен у линии F 4 от сорта Терция (110,2 см и 41,6 г) были больше (p < 0,05), чем у контрольных линий, а линия F 4 от линии Эритроспермум 4-16 (99,2 см и 39,9 г) не отличалась от контрольных линий. Длина главного колоса и число зерен в главном колосе у гибридной линии F 4 от Эритроспермум 4-16 (8,2 см и 39,2 шт.) были больше (p < 0,05), чем у контрольных линий, у гибридной линии F 4 от сорта Терция (7,7 см и 34,2 шт.) — не отличались от показателей у контрольных линий. Продуктивная кустистость (у линий F 4 от сорта Терция и F 4 от линии Эритроспермум 416 соответственно 2,5 и 2,4 колосьев на растение) была ниже (p < 0,05), чем у контрольных образцов.

Фиолетовозерная линия фBW49880P и ее родительская форма BW49880 имели наименьшую высоту растений, которая отличалась от таковой (p < 0,05) как у контрольных линий на основе сорта Саратовская 29, так и у отобранных линий. Продуктивная кустистость у этих линий была ниже, чем у контрольных линий на основе сорта Саратовская 29, но не отличалась от показателя у отобранных фиолетовозерных линий. Число колосков и зерен в главном колосе у сорта BW49880 были выше (p < 0,05), чем у контрольных линий на основе сорта Cаратовская 29 и фиолетовозерных линий, тогда как у линии фBW49880P эти показатели не отличались от таковых у контрольных линий. Обе линии имели статистически значимо большую массу 1000 зерен по сравнению с контрольными линиями и не отличались по этому параметру от сравниваемых отобранных фиолетовозерных линий.

• 3.    Развитие растений и структура урожая у образцов пшеницы ( Triticum aestivum L.) c различной окраской зерновок ( n = 12, M ±SD, опытное поле ИЦиГ СО РАН, г. Новосибирск, 2021 год)

  Показатель	Саратовская 29 (С29)	фC29PРF	F 4		BW49880	фBW49880P
  			Терция ½ С29 Pp3 P \	Эр 4-16 ½ С29 Pp3 P
  Цвет зерновок	Красный	Фиолетовый	Фиолетовый	Фиолетовый	Белый	Фиолетовый
  Высота растения, см	102,75±7,6b	101,1±6,2b	110,2±7,6с	99,2±5,9b	69,6±3,5а	66,2±4,4а
  Продуктивная кустистость, шт/раст.	3,3±1,2b	3,8±0,8b	2,5±0,5a	2,4±0,5a	2,2±0,6a	2,4±0,7a
  Длина главного колоса, см	7,1±0,5a	7,4±0,6a	7,7±0,8a	8,2±0,8b	8,9±0,9b	7,4±0,7a
  Число колосков в главном колосе, шт.	12,3±0,7a	12,6±0,8a	13,8±0,9b	13,0±3,4b	14,9±1,2c	11,5±0,8a
  Число зерен в главном колосе, шт.	31,8±1,5a	32,2±3,6a	34,2±4,8a	39,2±6,9b	44,8±6,2c	32,1±3,6a
  Число зерен с растения, шт.	75,8±23,8ab	93,8±24,6b	66,2±14,9a	78,3±14,3ab	85,7±26,4ab	57,1±12,3a
  Масса зерен с растения, г	2,9±0,9ab	3,3±0,9ab	2,8±0,7ab	3,1±0,7ab	3,7±1,2b	2,4±0,5a
  Масса 1000 зерен, г	37,5±3,8a	35,0±2,6a	41,6±2,1b	39,9±4,5ab	43,2±4,3b	42,0±4,2b
  a, b, с Различия между линиями статистически значимые при p < 0,05 (тест множественных сравнений Стьюдента-Ньюмена-Кеулса).

Зерна с растений F 4 полученных гибридных линий имели насыщенную антоциановую окраску. Мы определили ССА в цельнозерновой муке из созревших зерновок полевого материала (рис. 4).

Рис. 4. Суммарное содержание антоцианов ( n = 3, M ±SD ) в цельнозерновой муке у сортов и линий пшеницы ( Triticum aestivum L.). Слева — зерно фиолетовозерных линий и их родительских сортов (получено в условиях опытного поля ИЦиГ СО РАН, г. Новосибирск, 2021 год). Справа — пробирки с суспензиями выделенных из цельнозерновой муки антоцианов в растворе 1 % HCl в метаноле

Наивысший показатель ССА (244,3 мкг/г) выявлен в темно-фиолетовых зернах гибридной линии от скрещивания сорта Терция с неокрашенной линией С29 Рр3 ^P. Высокий показатель ССА (221,4 мкг/г) также имели темно-фиолетовые зерна гибридной линии фBW49880^P. Наименьшее значение ССА среди фиолетовозерных образцов (43,5 мкг/г) выявили в цельнозерновой муке почти-изогенной линии фC29^PРF.

Анализируя полученные результаты, отметим следующее. Для биосинтеза антоцианов в перикарпе зерновки пшеницы необходимо комплементарное взаимодействие двух генов Pp-1 и Pp3 (18). В отличие от доминантного аллеля гена Pp3 , который унаследован мягкой пшеницей от эндемичного вида пшеницы эфиопской и является редким, доминантные аллели гена Pp-1 , контролирующие синтез антоцианов не только в зерновке, но и в вегетативных органах, распространены среди различных видов пшеницы и культивируемых в настоящее время современных сортов. Поскольку содержание антоцианов в колеоптиле у сортов варьирует в широких пределах, что может быть обусловлено различными аллелями гена Pp-1 (24), вопрос о том, как эти аллели влияют на биосинтез антоцианов в зерне при их комбинировании с доминантными аллелями гена Pp3 , оставался открытым.

Для решения этого вопроса в проведенном нами исследовании были получены линии пшеницы с фиолетовой окраской зерновки на основе сортов и линий, не имеющих антоциановых пигментов в зерне, но несущих доминантные аллели либо гена Pp3 (С29Рр3P и С29Рр3PF), либо гена Pp-D1 (Сибирская 21, Терция, Эритроспермум 4-16). Используя внутригенный ДНК-маркер Pp3-diagnostic и SSR-маркеры Xgwm0044 и Xgwm0111, тесно сцепленные с геном Pp-D1, мы отобрали гибридные растения, несущие совместно доминантные аллели генов Pp-D1 и Pp3 в гомозиготном состоянии. Зерно со всех отобранных гибридов F2, выращенных в осеннюю вегетацию в гидропонной теплице, имело антоциановую окраску перикарпа с ССА в диапазоне от 34,1 до 84,2 мкг/г и не отличалось от контрольных образцов, содержащих в зерновке от 40,1 до 84,8 мкг/г антоцианов, за исключением контрольного образца фBW49880P с темно-фиолетовым зерном и ССА 213,2 мкг/г. Эти значения ССА согласуются с данными, полученными дру- гими авторами, которые оценили содержание антоцианов в зерновке пшеницы в пределах от 16,0 до 477 мкг/г (10, 14, 33, 34). Таким образом, имеется возможность использовать моногенное наследование гена Pp3 в скрещиваниях фиолетовозерной пшеницы с широко распространенными сортами мягкой пшеницы с окрашенным колеоптилем и стеблем, уже содержащими в геноме доминантные аллели генов Pp-1 (Pp-B1 или Pp-D1), для получения новых гибридов и сортов с фиолетовой окраской зерновки (27).

Среди гибридов F 2 , полученных в результате скрещивания с сортами, несущими доминантные аллели гена Pp-D1 , в двух комбинациях Терция ½ С29 Рр3 ^P и Эр 4-16 ½ С29 Рр3 ^P мы отобрали по одному растению с наибольшим содержанием антоцианов в зерне и размножили их до поколения F 4 . Полученные гибридные линии были протестированы в полевых условиях 2021 года. По результатам измерения ССА в цельнозерновой муке из зерен полевого материала гибридные линии F 4 Терция ½ С29 Рр3 ^P показали самое высокое значение (244,3 мкг/г), что практически в 3 раза превышало показатель в зернах от линии F 4 Эр 4-16 ½ С29 Рр3 ^P (86,4 мкг/г) и было сравнимо с ССА в темно-фиолетовых зернах ранее созданного гибрида фBW49880^P от селекционной линии, биообогащенной цинком (35). Интересно, что у полученной гибридной линии F 4 Терция ½ С29 Рр3 ^P, выращенной в полевых условиях, ССА в зерне было выше, чем в среднем у отобранных фиолетовозерных гибридных растений поколения F 2 , несущих в геноме доминантные аллели Pp3 и Pp-D1 . Это предполагает воздействие других, еще не изученных нами генов на биосинтез и сохранение антоцианов в перикарпе зерна.

Как было показано в ряде работ, на содержание антоцианов в зерне существенное влияние оказывают условия выращивания и агротехника (14, 36, 37). Наибольшее содержание антоцианов в перикарпе зерновок было выявлено в фазу восковой спелости (36, 37), в связи с чем ранняя уборка урожая фиолетовозерной пшеницы, богатой антоцианами, давала на 39 % больше антоцианов, чем более поздняя уборка (38). Показано, что применение удобрений с азотом, цинком, магнием повышало урожайность зерна и содержание антоцианов в фиолетовозерном рисе (39). Обработка магнием также увеличивала содержание антоцианов (36). Фиолетовозерные пшеницы накапливали значительно большее количество антоцианов при низком азотном стрессе (40). Несмотря на влияние среды на биосинтез антоцианов в тканях растений и варьирование их содержания у одного и того же сорта в различных агроэкологических условиях, генотип растения имеет решающее значение в проявлении признака (40).

Некоторые авторы предполагают, что накопление антоцианов может иметь отрицательную связь с урожайностью из-за дисбаланса энергии, необходимой для наполнения зерна, частично направленной на биосинтез пигментов (41). По данным структурного анализа полевого материала, отобранные фиолетовозерные гибридные линии F 4 Терция ½ С29 Рр3 ^P и F 4 Эр 4-16 ½ С29 Рр3 ^P не отличались от краснозерного сорта Саратовская 29 и ранее созданной на его основе фиолетовозерной почти-изогенной линии фC29^PРF (см. табл. 3). Отдельно надо отметить, что у фиолетовозерной гибридной линии фBW49880^P, несущей в геноме доминантные аллели генов Pp3 и Pp-D1 от сорта Purple, как и у ее белозерной родительской линии, растения были ниже (66,4 см и 69,5 см) в сравнении с сортом Саратовская 29 и остальными линиями, что не отразилось на их урожайности в ЗападноСибирском регионе.

Показавшие наибольшее ССА в зерне, выращенном в полевых условиях, линии F4 Терция ½ С29Рр3P и фBW49880P представляют собой перспективные селекционные образцы и ценные доноры не только генов окраски, но и комплекса генов, определяющих адаптивность к условиям Западной Сибири. Так, сорт Терция, полученный из гибридной популяции от ступенчатого скрещивания между собой изогенных линий на основе сорта Новосибирская 67 (АНК-2/АНК-3//АНК-1/3/АНК-7А), отнесен к высокоурожайному среднеспелому типу и включен в список особо ценных по качеству сортов Государственного реестра селекционных достижений, допущенных к использованию по Западно-Сибирскому региону (код сорта 9300473). Этот сорт характеризуется толерантностью к возбудителям некоторых рас бурой ржавчины и мучнистой росы, засухоустойчив, устойчивость к полеганию составляет 4,0-5,0 баллов. В поздних посевах возможно поражение стеблевой ржавчиной.

Линия BW49880 обладает комплексной устойчивостью к стеблевой и листовой ржавчине благодаря сочетанию генов Sr2 + Yr30 + Lr27 + Pbc , локализованных на хромосоме 3BS (42, 43). Кроме того, у линии снижена высота растений, которые имеют плотный неполегающий стебель, и она рассматривается как перспективный источник генов карликовости Rht . Фиолетовозерная гибридная линия, полученная на основе этой линии, — фBW49880^P в настоящее время используется в качестве донорного родителя в скрещиваниях с новыми коммерческими сортами Столыпинская 2 и Си-лантий, имеющими зеленые стебли.

Итак, в представленной работе показано, что сорта пшеницы с антоциановой окраской колеоптиля, стебля, подколосового междоузлия содержат доминантные аллели генов Pp-D1 , которые можно использовать в селекции фиолетовозерных линий. При скрещивании таких сортов с фиолетовозерными донорами доминантных аллелей генов Pp-D1 и Pp3 , полученными ранее селекционными методами, наследование признака окраски зерновки у гибридов будет определяться единственным геном Pp3 , уникальный аллель которого, контролирующий фиолетовую окраску перикарпа, был перенесен в геном мягкой пшеницы от тетраплоидного вида Triricum aethiopicum . Разработанный нами диагностический маркер этого гена Pp3-diagnostic позволяет уже на ранних стадиях развития выявить гомозиготные растения поколения F 2 , которые сформируют при созревании фиолетовое зерно, что повышает точность отбора и снижает трудоемкость селекционной работы. Созданные на основе сортов с окрашенными колеоптилями и стеблями линии не отличались по содержанию антоцианов от ранее полученных нами фиолетовозерных линий, несущих доминантные аллели генов Pp-D1 от доноров фиолетовой окраски зерна, а в некоторых случаях превосходили их по суммарному содержанию антоцианов в зерновке. Одна из темно-фиолетовозерных линий — фТерция Рр3 ^P, отобранная из гибридной комбинации с сортом Терция, и контрольная темно-фиолетовозерная линия фBW49880^P, созданная на основе белозерного синтетика BW49880, показали наибольшее накопление антоцианов в полевых условиях — соответственно 244,3 и 221,4 мкг/г. Эти линии были выбраны в качестве перспективных доноров для селекции новых сортов мягкой пшеницы. Коэффициент корреляции между суммарным содержанием антоцианов в зерне и в колеоптиле изучаемых линий составил r s = 0,83 (p = 0,0003). Полученные результаты важны не только для понимания особенностей накопления антоцианового пигмента в вегетативных органах мягкой пшеницы и в перикарпе зерновки, а также для селекции богатых антоцианами культурных сортов мягкой пшеницы.

Авторы благодарят Галину Владимировну Генералову и Ольгу Викторовну

Захарову за техническую помощь в работе.