Об устойчивости эпифитных цианобактерий Кольского залива к воздействию нефтяных углеводородов в водной среде

В настоящее время роль цианобактерий арктических морей в биодеградации нефтяных углеводородов (НУ) исследована в недостаточной степени. Бóльшая часть работ проведена в странах c умеренным климатом [1–6] или на юге России [7; 8].

В результате изучения вклада цианобактериальных матов в биодеградацию нефтепродуктов показано, что в разложении углеводородов непосредственное участие могут принимать ассоциированные с ними аэробные гетеротрофные бактерии [1].

Исследования отклика цианобактериальных матов на загрязнение нефтепродуктами осуществлялись с помощью культуральных методов [1–8], заключающихся в том, что в качестве объектов использовались части микробных матов, биопленки или альгологически чистые культуры. Работы, проведенные с аксеническими культурами цианобактерий, показали, что чистые культуры способны выдерживать загрязнение нефтепродуктами и расти в их присутствии [9]. При этом они могут не участвовать в расщеплении углеводородов ни автотрофно, ни гетеротрофно. Природные же цианобактериальные сообщества обладают высокой активностью окисления НУ [9].

Основной целью работы являлось определение устойчивости эпифитных цианобактериальных сообществ к нефтяному загрязнению с помощью культуральных методов и методов молекулярной биологии.

Материалы и методы

В качестве объекта исследования были выбраны эпифитные цианобактерии, обитающие на поверхности бурых водорослей Fucus vesiculosus L. Пробы водорослей отбирались на литорали на западном берегу южного колена Кольского залива в районе Абрам-Мыс (68º58' с. ш., 33º01' в. д.), где находится наибольшее количество источников загрязнения среды нефтепродуктами.

Выделение всей бактериальной ДНК эпифитных бактерий фукуса проводили по методу Total DNA с помощью фенол-хлороформной экстракции [10].

Для молекулярно-генетического анализа применяли метод секвенирования следующего поколения (NGS) – 454-секвенирование, GS FLX Titanium Series Lib-A Chemistry [11]. Секвенирование осуществляли в компании Macrogen Inc. (Южная Корея) по методике, разработанной компанией Roche (Южная Корея).

В ходе лабораторных экспериментов использовали культуры цианобактерий (чистые культуры Phormidium laetevirens, Leibleinia nordgaargii, выделенные с литорали Кольского залива, и смесь двух культур Leptolyngbya sp.) на питательной среде BG-11 [12], приготовленной на морской воде. Экспериментальное культивирование проводили в течение трех недель при искусственном освещении и в темноте в пробирках, завернутых в фольгу и помещенных в закрытый шкаф, в стандартной трехкратной повторности. В качестве нефтепродукта применяли летнее дизельное топливо (ДТ), которое в избытке добавляли в питательную среду в количестве до 3,5 мг/л. Это значительно превышает ПДК (0,05 мг/л), однако может соответствовать содержанию НУ при разливах нефти.

Препараты цианобактерий исследовали с помощью метода прямого микроскопирования в световом микроскопе Микромед-2 с фотокамерой.

Электронно-микроскопические фотографии получены на трансмиссионном электронном микроскопе (ТЭМ) JEM-1011 (JEOL).

Результаты и обсуждение

Характерной особенностью акватории Кольского залива с хроническим нефтяным загрязнением является большая доля в них цианобактерий, которая достигает 6,8 % всего бактериального сообщества [13; 14]. В результате молекулярно-генетического анализа были идентифицированы представители группы IV (Gp IV), относящейся к семейству IV (Family IV), и группы VIII (Gp VIII), относящейся к семейству VIII (Family VIII). Первые являются цианобактериями LPP типа (рода Lyngbya, Plectonema, Phormidium) и представляют собой нитчатые структуры, не образующие гетероцист [15; 16]. Вторые представлены цианобактериями рода Pleurocapsa и родственными ему родами [16; 17]. Они могут быть одноклеточными, формировать цепочки, образовывать беоциты (мелкие репродуктивные клетки) путем множественных делений материнских клеток. Организмы обеих групп не являются азотфиксирующими.

Нами были обнаружены как одиночные клетки, так и нити, а также колониальные формы, представляющие собой мелкие клетки (1–2 мкм), заключенные в единую оболочку-чехол (рис. 1).

а                                                  б

Рис. 1. Эпифитные цианобактерии: а – чехол с клетками; б – клетки эпифитных цианобактерий Fig. 1. Epiphytic cyanobacteria: a – "shells" with cells; б – cells of epiphytic cyanobacteria

У нитчатых форм цианобактерий, обитающих на поверхности водорослей в районе с ярко выраженным хроническим загрязнением, отмечается отсутствие гетероцист.

В литературе есть сведения о возможности адаптации цианобактерий к загрязнению среды нефтепродуктами [18; 19] и способности многих из них переходить к фотогетеротрофному и даже полностью к гетеротрофному образу жизни [20]. По данным литературы, присутствие цианобактерий в ассоциациях с углеводородокисляющими микроорганизмами может приводить к увеличению численности последних в эпифитных бактериоценозах [21; 22].

Для определения устойчивости цианобактерий к загрязнению нефтепродуктами были использованы чистые лабораторные культуры цианобактерий, выделенные с литорали Кольского залива.

При культивировании с ДТ на свету ни одна из культур не показала видимого роста. В посевах как без ДТ, так и с ДТ, содержащихся в условиях темноты, обнаружен слабый рост двух культур (Ph. laetevirens, L. nordgaardii), у третьей культуры (смесь двух видов Leptolyngbya sp.) роста не наблюдалось. В литературе имеются сведения, что углеводородокисляющая активность неаксенических культур цианобактерий (Oscillatoria str.), культивируемых как на свету, так и в темноте, минимальна [23].

Микроскопические исследования культур цианобактерий из опытных и контрольных пробирок показали их различия (рис. 2).

Так, культуры цианобактерий Ph. laetevirens и L. nordgaardii, выращенные на свету в среде с ДТ, потеряли пигментацию клеток (рис. 2, г, д). При этом в их культуральной жидкости отмечено значительное развитие гетеротрофных бактерий и плесневых грибов; особенно это заметно в культуре L. nordgaardii (рис. 2, д). Культуры же цианобактерий в средах с ДТ, инкубированных в темноте (рис. 2, а–в), показали способность к росту и изменение пигментации в сторону увеличения синего окрашивания (рис. 2, б, в) за счет фикоцианина, что, возможно, связано с изменением соотношения фикоцианин/хлорофилл вследствие разрушения последнего при длительной экспозиции в темноте. Аналогичное явление отмечено и для культур в средах без ДТ, культивированных без света.

Рис. 2. Микроскопические препараты культур цианобактерий из опытных пробирок при увеличении ×400: а – Ph. laetevirens без ДТ на свету (контроль); б – Ph. laetevirens без ДТ в темноте; в – Ph. laetevirens с ДТ в темноте; г – Ph. laetevirens с ДТ на свету; д – L. nordgaardii c ДТ на свету (отмечены стрелками) Fig. 2. The cultures of cyanobacteria from experimental tubes. Magnification ×400:

a – Ph. laetevirens without diesel fuel in the light (control); б – Ph. laetevirens without diesel fuel in the dark; в – Ph. laetevirens with diesel fuel in the dark; г – Ph. laetevirens with diesel fuel at the light;

д – L. nordgaardii c diesel fuel at the light (marked with arrows)

Наличие даже слабого роста лабораторных культур цианобактерий в присутствии НУ в темноте может указывать на способность указанных штаммов цианобактерий к гетеротрофному существованию в данных условиях, а также на снижение токсичности нефтепродукта в пробирках из-за деградации углеводородов ассоциированными с цианобактериями гетеротрофными бактериями при отсутствии света.

В пользу первого предположения свидетельствует доказанный факт способности некоторых видов цианобактерий переходить на гетеротрофное питание [24; 25]; в пользу второго – наличие тесных взаимосвязей между слизистыми чехлами цианобактерий и ассоциированными на них гетеротрофными бактериями, углеводородокисляющая активность которых может увеличиваться в присутствии в среде продуктов метаболизма цианобактерий, образующихся в том числе и в темноте [2; 23; 26].

Отсутствие видимого роста смешанных культур цианобактерий (смешанной культуры двух видов Leptolyngbya sp.) в пробирках с ДТ как на свету, так и в темноте может указывать либо на токсичность ДТ для данных микроорганизмов, либо на их неспособность к росту при изменении условий культивирования. Подобные выводы были сделаны и другими исследователями после изучения культур цианобактерий Halomicronema excentricum [6; 23] и Microcoleus chthonoplasts [6].

Заключение

При исследовании таксономической структуры эпифитных бактериальных сообществ в загрязненных акваториях отмечалась большая доля цианобактерий и слабый рост чистых культур в условиях лаборатории. Можно сделать предположение, что сформировавшееся в загрязненной НУ природной среде сообщество цианобактерий не всегда удается культивировать в лабораторных условиях на питательных средах с добавлением НУ. При этом с большой долей уверенности можно утверждать, что цианобактериальное сообщество южного колена Кольского залива является устойчивым к хроническому нефтяному загрязнению.