Обнаружение амоксициллина в молоке методом анализа температурных зависимостей фотолюминесценции

ЭЛЕКТРОТЕХНОЛОГИИ И ЭЛЕКТРООБОРУДОВАНИЕ / ELECTRICAL TECHNOLOGIES AND EQUIPMENT

EDN: updates 0:0: УДК / UDK 628.9.037-035.571:577.182

Федеральный научный агроинженерный центр ВИМ, г. Москва, Российская Федерация, н

Federal Scientific Agroengineering Center VIM, Moscow, Russian Federation, ■

Повышение безопасности, контроль качества продукции, создание инновационных моделей с применением искусственного интеллекта являются одними из важных задач сельского хозяйства [1]. Внедрение цифровых систем и автоматизированного контроля в сельскохозяйственные предприятия необходимо для конкурентоспособности России [2]. В число таких контрольно-аналитических процедур может входить проверка на остаточное содержание антибиотиков в продуктах питания, в частности, в молоке. Производители сельхозпродукции, применяющие антибиотики, обязаны гарантировать безопасность продукции для потребителя [3; 4].

Пенициллиновая группа антибиотиков - одна из распространенных антибактериальных средств для лечения молочного скота [5]. Так, амоксициллин составляет 40,47 % от общего числа всех применяемых антибиотиков [6]. При бесконтрольном использовании антибиотики могут накапливаться в организме сельскохозяйственного животного и длительное время циркулировать в нем. Впоследствии их соединения могут мигрировать в продукты животноводства, такие как молоко и мясо. При употреблении этих продуктов у потребителя могут возникнуть иммунопатологические эффекты, репродуктивные расстройства и др. [7; 8]. В связи с этим особую актуальность приобретает разработка современных приборов и экспресс-методов для контроля содержания антибиотиков в молоке.

Получение зависимостей интенсивности люминесценции от температуры молока, а также их анализ в зависимости от концентрации амоксициллина позволит дать начало разработке доступных и простых в использовании аналитических приборов. В последующем будет возможен переход к системе тотального входящего и выходного контроля молока как на самой ферме, так и при приеме его на завод. Оптические методы, в том числе основанные на концентрационном и температурном тушении люминесценции, являются быстродействующими, селективными, неразрушающими и относительно недорогими. Применение данных технологий не только будет гарантировать безопасность готовой продукции для потребителя, но и даст экономические выгоды производителям путем предотвращения поступление непригодных партий сырья и экономии на экспресс-тестах, таких как тест-полоски.

Цель исследования – изучение температурных зависимостей спектральных характеристик люминесценции молока при загрязнении амоксициллином для Electrical technologies and equipment 563

^® ИНЖЕНЕРНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ И СИСТЕМЫ Том 36, № 3. 2026 определения информативных диапазонов и последующей разработки методики контроля наличия антибиотиков. Для этого необходимо: измерить люминесцентные фотосигналы при различных температурах молока; аппроксимировать полученные зависимости и расчет параметров температурной чувствительности люминесценции молока; определить оптимальные длины волн возбуждения при температурном контроле люминесценции молока.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Широкое применение оптических методов для обнаружения антибиотиков в последние двадцать лет объясняется их ключевыми преимуществами: быстрый цикл анализа, высокая чувствительностью и простота [9].

В настоящий момент разработан метод для обнаружения антибиотиков в молоке, основанный на технологии биофотоники [10]. Зарубежные ученые создали оптический плазмонный сенсор, с помощью которого определяется наличие пенициллина в молоке [11], и оптоволоконный датчик для обнаружения бетта-лактамных антибиотиков в продуктах питания [12]. Исследователи из Турции и Китая активно применяют на практике метод поверхностного плазмонного резонанса для обнаружения антибиотиков[13; 14].

Для быстрого и чувствительного обнаружения амоксициллина в молоке широко применяются флуоресцентные зонды [15]. Они позволяют проводить селективный анализ, что делает их перспективной альтернативой традиционным способам [16].

Среди популярных методов диагностики антибиотиков в молоке активно используются современные инструментальные методы, такие как масс-спектрометрия, рамановская, инфракрасная и энергодисперсионная спектроскопия. Они обеспечивают высокую чувствительность и селективность анализа. Например, применение энергодисперсионной спектроскопии позволяет осуществлять детектирование амоксициллина в молоке [17]. На основе поверхностно-усиленной рамановской спектроскопии разработан простой и недорогой метод определения следовых количеств амоксициллина [18]. Остаточное количество амоксициллина в молоке определяется с помощью масс-спектрометрии и жидкостной хроматографии [19]. Коллектив ученых из Бразилии изучил процесс обнаружения амоксициллина с помощью инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье для совершенствования мониторинга антибиотиков [20]. Однако применение данных методов требует наличия дорогостоящего оборудования, квалифицированного персонала и значительного времени на проведение исследований. Это обусловливает их малопригодность для повседневного оперативного контроля на фермах, молокозаводах и в пунктах приема сырья.

Использование нанотехнологий, таких как углеродные наноточки, открывает новые возможности для обнаружения следов антибиотиков в молоке. Разработаны углеродные наноточки, легированные азотом, с температурным и флуоресцентным сенсорами для диагностики тинидазола в молоке [21]. Синтезированы высокоаффинные наночастицы, которые используются при разработке сенсора на основе поверхностного плазмонного резонанса для обнаружения ципрофлоксацина, моксифлоксацина и офлоксацина в молоке [22]. Разработан нанофермент на основе полиоксометалата с активностью, имитирующей лакказу, для обнаружения канамицина с помощью колориметрического анализа в молоке [23].

Изучена возможность диагностики амоксициллина в молоке с помощью люминесцентной спектроскопии [24]. С применением тербия Tb(III) разработан способ люминесцентной диагностики левофлоксацина [25]. Велась разработка функционализированного кремниевого нанозонда на основе комплекса европия Eu3+ для люминесцентного определения тетрациклина [26].

Анализ литературы показал, что в настоящее время недостаточно информации об изменениях температурных спектров фотолюминесценции при добавлении в молоко амоксициллина. Также неизвестно, может ли данное изменение быть уникальным бесконтактным способом для диагностики остаточных антибактериальных средств в молочном сырье. Ключевым пробелом является отсутствие систематических баз данных о температурных зависимостях молока с антибиотиками. В связи с этим есть необходимость в построении температурных спектров фотолюминесценции в диапазоне 10–60 °C для образцов с разной концентрацией антибиотика, что позволит разработать обоснованный критерий детектирования, не требующий сложной химической пробоподготовки.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Методы, оборудование и процедура исследования

В качестве исследуемого материала было использовано молоко агрофирмы «Мичурино» с жирностью 3,2 %. В него добавляли раствор амоксициллина для получения концентрации 0,004 мкг/см3, которая является пороговой в соответствии с Техническим регламентом Таможенного союза 033/20131. В качестве арбитражного метода контроля антибиотиков использовали тестовый набор «BIOEASY» 4in1 BSCT. Измерение спектров возбуждения и люминесценции осуществляли в ближнем ультрафиолетовом и видимом диапазоне на спектрофлуориметре СМ 2203 (рис. 1).

Р и с. 1. Внешний вид спектрофлуориметра СМ 2203

F i g. 1. Appearance of the CM 2203 spectrofluorimeter

Источник: фотография для рисунка 1 сделана авторами статьи в июле 2025 г. в лаборатории Инновационных технологий и технических средств кормления в животноводстве Федерального научного агроинженерного центра ВИМ.

Source: The photo for Figure 1 was taken by the authors of the article in July 2025, in the Laboratory of Innovative Technologies and Technical Means of Feeding in Animal Husbandry of the Federal Scientific Agroengineering Center VIM.

Данный спектрофлуориметр оборудован термостатируемым держателем для кварцевых кювет. Процесс варьирования температуры молока осуществляли в диапазоне от 10 до 60 °C с шагом 1 °C, параллельно осуществляя спектральные измерения. Система обратной связи на спектрофлуориметре, включающая датчик температуры и нагревательный элемент, автоматически регулировала мощность нагрева для поддержания заданной температуры, что гарантировало высокую стабильность в ходе эксперимента. Контроль температуры проводился в связи с выраженной зависимостью спектральных характеристик биологических объектов от термических условий.

Подбор длин волн для получения спектральных характеристик возбуждения молока осуществляли по максимумам спектральных характеристик при синхронном сканировании. Спектральные характеристики возбуждения молока измеряли с шагом 0,2 нм для получения их максимумов спектров. Полученные максимумы составляли 295, 325, 375 и 457 нм. Далее полученными максимумами длин волн осуществляли возбуждение молока и регистрацию люминесценции, а именно:

– λ _е = 295 нм, диапазон регистрации 300–450 нм;

– λ _е = 325 нм, диапазон регистрации 355–650 нм;

– λ _е = 375 нм, диапазон регистрации 420–660 нм;

– λ _е = 457 нм, диапазон регистрации 480–660 нм.

Люминесцентные характеристики, как и характеристики возбуждения, измеряли с шагом 0,2 нм, чувствительность фотоэлектронного умножителя «Средняя».

Измерение зависимости спектральной плотности потока от температуры ф( T осуществляли при средней чувствительности фотоэлектронного умножителя и низкой скорости сканирования для минимизации флуктуаций сигнала при измерениях. В качестве длин волн возбуждения и регистрации выбрали значения, являющиеся максимумами спектров возбуждения и люминесценции, а именно: λ _е = 295 нм, А r = 360 нм; А е = 325 нм, A r = 439 нм; А е = 325 нм, A r = 516 нм; А е = 375 нм, A r = 546 нм; А е = 457 нм, A r = 542 нм.

Обработка результатов измерений

Для объективной оценки «точек излома» Ψ графиков φ( T ) при изменении их угла наклона осуществляли построение касательных к левому и правому участку кривых. После этого осуществляли их аппроксимацию линейными функциями с последующим расчетом коэффициента детерминации R ². В математическом пакете Microcal Origin находили точку пересечения Т аппроксимационных кривых. Абсцисса координат данной точки Ψ является граничной температурой излома T .

Чувствительность люминесценции S к изменению температуры вычисляли по формуле:

S =     ,

Д T где Δφ – разность конечной и начальной интенсивности фотолюминесценции (спектральной плотности потока) на участке температур ΔT, о. е.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

На первом этапе были получены спектры возбуждения. По их максимумам были подобраны эффективные длины волн излучения для получения максимального сигнала фотолюминесценции, после чего экспериментально установили оптимальные диапазоны ее регистрации (рис. 2).

Р и с. 2. Спектральные характеристики возбуждения и люминесценции молока при длинах волн возбуждения: а) 295 нм; b) 325 нм; c) 375 нм; d) 457 нм

F i g. 2. Spectral characteristics of excitation and luminescence of milk at excitation wavelengths: a) 295 nm; b) 325 nm; c) 375 nm; d) 457 nm

Источник: графики для рисунков 2–6 составлены авторами статьи в программе Microsoft Excel.

Source: Figures 2–6 were compiled by the authors of the article with the use of Microsoft Excel.

На втором этапе были получены температурные спектры фотолюминесценции молока без амоксициллина и с пороговой его концентрацией 0,004 мкг/см³. На рисунках 3–6 представлены спектры люминесценции молока с амоксициллином и без при возбуждении излучением 295, 325, 375 и 457 нм соответственно, а также их температурные зависимости φ( T ).

о

о

Интенсивность люминесценции молока с концентрацией антибиотика 0 мкг/см3 / Luminescence intensity of milk with an antibiotic concentration of 0 mcg/cm3 Интенсивность люминесценции молока с концентрацией антибиотика 0,004 мкг/см3 / Luminescence intensity of milk with an antibiotic concentration of 0.004 mcg/cm3

• •    Точка излома % °C / The breaking point W, °C

^^“ Линия тренда / Trend line

Р и с. 3. Температурные спектры люминесценции при λ _е = 295 нм, λ _r = 360 нм молока с различным содержанием амоксициллина

F i g. 3. Temperature spectra of luminescence of milk with different amoxicillin content at λ _e = 295 nm, λ _r = 360 nm

О

Интенсивность люминесценции молока с концентрацией антибиотика 0 мкг/см3 /

Luminescence intensity of milk with an antibiotic concentration of 0 mcg/cm3

О

Интенсивность люминесценции молока с концентрацией антибиотика 0,004 мкг/см3 / Luminescence intensity of milk with an antibiotic concentration of 0.004 mcg/cm3

। Точка излома T, С / The breaking point T, C

« Линия тренда / Trend line

Р и с. 4. Температурные спектры люминесценции молока с различным содержанием амоксициллина: а) λ _е = 325 нм, λ _r = 439 нм; b) λ _е = 325 нм, λ _r = 516 нм

F i g. 4. Temperature spectra of luminescence of milk with different amoxicillin content: а) λ _e = 325 nm, λ _r = 439 nm; b) λ _e = 325 nm, λ _r = 516 nm

(p, o.e. /

(p, r.u.

10     20     30     40     50     60 T’°c

О Интенсивность люминесценции молока с концентрацией антибиотика 0 мкг/см3 / Luminescence intensity of milk with an antibiotic concentration of 0 mcg/cm3

О Интенсивность люминесценции молока с концентрацией антибиотика 0,004 мкг/см3 / Luminescence intensity of milk with an antibiotic concentration of 0.004 mcg/cm3

• •    Точка излома Т, °C / The breaking point 4^J, °C

^^“ Линия тренда / Trend line

Р и с. 5. Температурные спектры люминесценции при λ _е = 375 нм, λ _r = 546 нм молока с различным содержанием амоксициллина

F i g. 5. Temperature spectra of luminescence of milk with different amoxicillin content at λ _e = 375 nm, λ _r = 546 nm

О Интенсивность люминесценции молока с концентрацией антибиотика 0 мкг/см3 / Luminescence intensity of milk with an antibiotic concentration of 0 mcg/cm3

О Интенсивность люминесценции молока с концентрацией антибиотика 0,004 мкг/см3 / Luminescence intensity of milk with an antibiotic concentration of 0.004 mcg/cm3

• •    Точка излома Т, °C / The breaking point T, °C

^^“Линия тренда / Trend line

Р и с. 6. Температурные спектры люминесценции при λ _е = 457 нм, λ _r = 542 нм молока с различным содержанием амоксициллина

F i g. 6. Temperature spectra of luminescence of milk with different amoxicillin content at λ _e = 457 nm, λ _r = 542 nm

Рассчитанные по формуле (1) параметры температурных спектров люминесценции представлены в таблице.

Т а б л и ц а

T a b l e

Интегральные и температурные параметры спектров люминесценции молока Integral and temperature parameters of milk luminescence spectra

λ e , нм / λ e , nm	λ r , нм / λ r , nm	Параметры / Parameters	C , мкг/см3 / C , mcg/cm3
			0	0,004
		Точка излома Ψ, °C / The break point Ψ, °C	25,5±0,3	25,7±0,2
		S 10-26 , о. е./°C / S 10-26 , r. u./°C	0,029±0,001	0,021±0,001
295	360	S 26-60 , о. е./°C / S 26-60 , r. u./°C	0,042±0,001	0,043±0,002
		R 2 10-26	0,98±0,10	0,99±0,10
		R 2 26-60	0,99±0,10	0,99±0,10
		Точка излома Ψ, °C / The breaking point Ψ, °C	34,3±0,2	36,3±0,3
		S 10-36 , о. е./°C / S 10-36 , r. u./°C	0,158±0,006	0,226±0,012
	439	S 36-60 , о. е./°C / S 36-60 , r. u./°C	0,038±0,002	0,042±0,002
		R 2 10-36	0,99±0,10	0,98±0,10
325		R 2 36-60	0,97±0,10	0,99±0,10
		Точка излома Ψ, °C / The break point Ψ, °C	32,6±0,3	32,2±0,3
		S 10-32 , о. е./°C / S 10-32 , r. u./°C	0,162±0,007	0,196±0,008
	516	S 32-60 , о. е./°C / S 32-60 , r. u./°C	0,032±0,002	0,039±0,002
		R 2 10-32	0,99±0,10	0,97±0,10
		R 2 32-60	0,97±0,10	0,99±0,10
		Точка излома Ψ, °C / The break point Ψ, °C	25,8±0,4	23,6±0,2
		S 10-25 , о. е./°C / S 10-25 , r. u./°C	0,039±0,002	0,028±0,001
375	546	S 25-60 , о. е./°C / S 25-60 , r. u./°C	0,091±0,003	0,102±0,005
		R 2 10-25	0,97±0,10	0,99±0,10
		R 2 25-60	0,92±0,10	0,99±0,10
		Точка излома Ψ, °C / The break point Ψ, °C	29,0±0,3	30,8±0,5
		S 10-31 , о. е./°C / S 10-31 , r. u./°C	0,0170±0,0008	0,0030±0,0001
457	542	S 31-60 , о. е./°C / S 31-60 , r. u./°C	0,070±0,004	0,084±0,004
		R 2 10-31	0,84±0,10	0,31±0,10
		R 2 31-60	0,99±0,20	0,99±0,20

Источник: таблица 1 составлена авторами статьи.

Source: The table 1 was compiled by the authors of the article.

Полученные зависимости φ( T ) следует разделить на два участка, каждый из которых можно аппроксимировать линейными характеристиками с точками излома Ψ. Относительная погрешность чувствительностей S не превышает 7 %.

ОБСУЖДЕНИЕ

Температурные характеристики φ( T ) чистого молока количественно меньше, чем у молока с антибиотиком. Все характеристики можно разделить на две части: с разным наклоном и с выраженными точками излома Т. При X е = 325 нм зависимости φ( T ) вогнутые, а при длинах волн возбуждения 295, 375 и 457 нм – выпуклые.

Возбуждение на 295, 325 и 375 нм определяется в основном триптофаном, витамином А и белками [27-29]. Для X е = 457 нм основной вклад вносит рибофлавин – витамин B2 [30]. Значительное температурное тушение происходит при возбуждении излучением 295 и 325 нм: уменьшение сигнала фотолюминесценции φ относительно начальной (10 °С) и конечной (60 °С) температуры составляет от 60 до 79 %. Данное уменьшение сигнала в основном связано с денатурацией белка и в меньшей степени с флуктуациями триптофана и витамина А, так как в данном температурном диапазоне они практически не разрушаются. При длинах волн возбуждения 375 и 457 нм (рис. 5, 6) уменьшение интенсивности ф в температурном диапазоне 10–60 °С составляет от 12 до 29 %, так как витамин B2 считается стойким по отношению к нагреванию. Не все технологические температурные режимы при производстве молочных продуктов способны привести к разрушению антибактериальных препаратов [31].

Для каждой длины волны возбуждения имеется своя точка излома. Например, для X е = 295 нм и X r = 360 нм - T = 25,5 °С; для X е = 325 нм и X r = 516 нм - T = 32,2 °С и с добавлением антибиотика практически не изменяется. Для X е = 325 нм и X r = 439 нм, X е = 375 нм и X r = 546 нм - T уменьшается на 2 °С при добавлении амоксициллина. При X е = 457 нм и X r = 542 нм наоборот увеличивается на 1,8 °С. т. е. по точке излома можно сделать вывод о наличии или отсутствии амоксициллина в молоке.

Чувствительность S , являющаяся отношением разности интенсивности люминесценции и температуры, вычисляемая по формуле (1), для областей с меньшими и большими температурами – разная. Например, с добавлением амоксициллина в молоко для X е = 295 нм и X r = 360 нм, X е = 375 нм и X r = 546 нм, X е = 457 нм и X r = 542 нм чувствительность в диапазоне температур 10-30 °С уменьшается на 38, 28 и 83 % соответственно. Для двумодальной фотолюминесцентной характеристики, возбуждаемой 325 нм и регистрируемой на X r = 439 нм и X r = 516 нм, наоборот увеличивается с добавлением антибиотика на 31 и 18 % соответственно. Расчет чувствительности в высокотемпературном диапазоне при длинах волн регистрации 360 и 439 нм не является информативным. С другой стороны, при X r = 516 нм и 546 нм чувствительность изменяется от 11 до 18 %.

При линейной аппроксимации участков зависимостей ф( T ) коэффициент детерминации R ²> 0,97 на всех измеряемых длинах волн и температурных диапазонах, кроме X е = 457 нм, X r = 542 нм, где для молока без антибиотиков наблюдается планомерное изменение сигнала в диапазоне температур от 10–31 °С с R ²= 0,84±0,1, а с антибиотиками с R ² = 0,31±0,1. Это может быть связано с влиянием амоксициллина на длинноволновую область возбуждения молока.

Относительная погрешность не превышает 2 % для точек излома Ψ и 5–7 % для чувствительности S в зависимости от температурной области измерения. При определении коэффициентов детерминации графиков ф(T погрешность составляет до 10 % для длин волн возбуждения 295, 325 и 375 нм. Для длины волны возбуждения 457 нм данная погрешность возрастает до 35 %.

Ограничением исследования является измерения только в тех спектральных диапазонах, где происходит возбуждение фотолюминесценции (коротковолновый видимый и ближний ультрафиолетовый диапазон), а также необходимость учета времени нагрева и охлаждения пробы молока при внедрении данного метода в существующие технологии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные температурные характеристики могут быть учтены при разработке различных методик фотолюминесцентного контроля качества молока (наличие антибиотиков и других посторонних компонентов, кислотность, содержание белков, жиров и др.) в связи с тем, что температура меняется примерно от 37 °C у свежевыдоенного молока до 3-5 °C при хранении. При этом меняются количественные параметры люминесценции. Так, наибольшая температурная стабильность фотолюминесцентного сигнала наблюдается при использовании длин волн возбуждения 295, 375 и 457 нм.

Для выявления антибиотиков в молоке по температурным свойствам рекомендуется методика, основанная на регистрации φ( T ) или интегрального потока Φ( T ) в диапазоне 10–36 °C. При данных температурах молоко не подвергается существенному термическому разрушению. Методика включает в себя следующие этапы:

• –    возбуждение молока излучением от светодиодов либо лазера при длине волны X е = 325 нм;

• -    нагревание молока с шагом в 1 °С в диапазоне температур 10-36 °C и регистрация сигнала люминесценции ф на длине волны X r = 439 нм, используя приемник излучения с монохроматором или режекторным фильтром с последующим переводом полученного сигнала в цифровую форму микроконтроллером;

• –    построение графика φ( T ) молока с последующим расчетом чувствительности S . Если S > 0,17 – в молоке присутствует амоксициллин, если S < 0,17 – отсутствует.

Дальнейшим направлением исследования является расширение номенклатуры определяемых антибиотиков.