Обоснование чувствительности иммунохроматографического анализа в зависимости от локализации детектируемого антигена

Хеликобактериоз – инфекционное заболевание, дочно-кишечного тракта человека и животных вызываемое бактерией Helicobacter pylori, которая [Госманов, Нургалиев, Нургалиев, 2012].

имеет выраженную тропность к эпителию желу- Основными антигенами H. pylori , играющими значительную роль в патогенезе H. pylori -

ассоциированных заболеваний и представляющими интерес для разработки различных тест-систем и вакцинных препаратов, являются VacA-цитотоксин, CagA-протеин и другие высокомолекулярные белки, уреаза, липополисахарид клеточной стенки, специфический водорастворимый протеин [Гордина, Богачева, Дармов, 2017].

Вакуолизирующий цитотоксин VacА вызывает образование вакуолей в эпителиоцитах и их гибель. В гене vacA, ответственном за синтез цитокина, выделяют сигнальный регион – s и серединный – m, в каждом из которых – по два аллельных варианта – s1 и s2, m1 и m2 [Макаренко. Воропаева, 2004]. Штаммы с генотипом vac As1m1 продуцируют увеличенное количество цитотоксина по сравнению со штаммами vac As2m2, и поэтому чаще ассоциированы с гастродуоденальными язвами [Макаренко, Воропаева, Матвеенко, 2009].

Достаточно высока значимость в патогенезе хеликобактериоза фермента уреазы, защищающего микроорганизм от агрессивного воздействия соляной кислоты желудочного сока путем разрушения мочевины с образованием углекислого газа и аммиака. Уреаза имеет белковую природу и состоит из двух субъединиц UreA (29,5 кДа) и UreB (66 кДа). Уреаза вырабатывается в процессе жизнедеятельности внутри клетки и выделяется в окружающую среду. Определение уреазы или антител к ней является основой диагностических тестов на косвенное обнаружение в организме данного патогена [Гордина, Богачева, Дармов, 2017].

Диагностика большинства инфекционных заболеваний, в том числе и хеликобактериоза, направлена на детекцию антигенов возбудителя заболевания. Большинство используемых в настоящее время диагностических тест-систем направлено на определение поверхностных антигенов. Не являет- ся исключением это и для пользующихся в настоящее время популярностью иммунохромато-графических тест-систем. В качестве примеров можно привести иммунохроматографические тест-системы для диагностики легионеллеза [Ярков и др., 2009], бруцеллеза [Бызова и др., 2012], псевдотуберкулеза [Богачева, Елагин, Печенкин, 2016], сапа и мелиоидоза [Федюкина, Ветчинин, Баранова, 2015].

Основные же антигены патогенности H. pylori расположены внутриклеточно.

Цель работы – определение влияния локализации целевого антигена на чувствительность имму-нохроматографического метода анализа.

Материал и методы исследования

Материал

В качестве культур для тестирования были выбраны H. pylori, хранящиеся в музейной коллекции кафедры микробиологии «Вятского государственного университета». Данные культуры были получены от лиц, имеющих в анамнезе заболевания желудочно-кишечного тракта. Использовали чистую культуру микроорганизма, принадлежность которой к H. pylori была подтверждена молекулярно-генетическим, биохимическим и бактериологическим методом, а также коммерческим антигеном AGHPY-0100 («Arista Biologicals», США), в состав которого входят внутриклеточные белки H. pylori , ассоциированные с генами cagA (120 kd) и vac A (87 kd) и уреазой .

Методы исследования

Культуры H. pylori выращивали на селективной питательной среде – колумбийском кровяном агаре с антибиотиками амфотерицином и ванкомицином в анаэростате при температуре 37°С в течение 3 - 5 сут.

Принадлежность культур к H. pylori подтверждалась бактериологическими и биохимическим методами, к числу которых относятся оксидазный тест «Oxi-тест» («Микро-Ла-Тест», Россия), уреазный тест и каталазный тест, методом ПЦР при использовании коммерческих тест-систем «Хелико-пол VA», «Хеликопол CA», «Хеликопол IA», «Хе-ликопол BA» (Россия), «ДНК-технологии» (Россия), методом иммунохроматографии при использовании коммерческой тест-системы «РЭД Helicobacter pylori » (Россия). Иммунохроматографиче-ский анализ проводили с использованием коммерческой тест-системы «РЭД Helicobacter pylori » (Россия), предназначенной для индикации фермента уреазы H. pylori.

Результаты и их обсуждение

Принцип иммунохроматографического анализа заключается в специфическом взаимодействии клеток H. pylori с моноклональными антителами, конъюгированными с окрашенной меткой. В аналитической зоне образовавшийся комплекс взаимодействует с моноклональными антителами, иммобилизированными на поверхности мембраны. В контрольной зоне тест-полоски окрашенный иммунокомплекс образуется вне зависимости от наличия в тестируемом биологическом материале клеток H. pylori.

Если в анализируемом образце присутствуют клетки H. pylori , то на тест-полоске образуются две параллельные окрашенные линии (красная аналитическая, обозначенная буквой Т, и зеленая контрольная, обозначенная буквой С), что указывает на положительный результат анализа. В том случае, если в анализируемом образце нет клеток H. pylori, то на тест-полоске образуется одна зеленая контрольная линия (С), что свидетельствует об отрицательном результате анализа.

На первом этапе провели тестирование имму-нохроматографической тест-системы «РЭД Helicobacter pylori » с использованием антигена AGHPY-0100 с исходной концентрацией 2.5 мг/мл, который предварительно развели до концентрации 20 мкг/мл буфером для растворения образца, входящего в состав набора. Далее сделали ряд последовательных разведений антигена с шагом 10 и получили концентрации антигена 20 000, 200, 20, 2 нг/мл.

В круглое окошко кассеты (S) вносили 100 мкл раствора антигена AGHPY-0100 с определенной концентрацией и через 10 мин. визуально оценивали результаты анализа (рис. 1).

Рис. 1 . Проверка чувствительности иммуно-хроматографической тест-системы «РЭД Helicobacter pylori» с антигеном AGHPY-100.

Концентрация антигена, нг/мл: 1 – 20 000 2 – 200, 3 – 20, 4 – 2

По результатам тестирования с коммерческим антигеном AGHPY-0100 порог чувствительности тест-системы «РЭД Helicobacter pylori » составил не менее 20 нг/мл, что свидетельствует о высокой чувствительности тест-системы.

На следующем этапе работы провели тестирование иммунохроматографической тест-системы с инактивированной культурой H. pylori , концентрация которой с использованием отраслевого стандарта мутности ФГБУ «НЦЭСМП» МЗ РФ (ОСО 42-28-85П) была определена как 1×10¹⁰ м.к.×см^-3.(цельная культура, смытая с чашки Петри). С цельной культурой результат тестирования оказался положительным. Далее сделали следующий шаг – проверили чувствительность тест-системы, используя миллиардную культуру H. pylori. Результат оказался отрицательным.

На рис. 2 представлен результат тестирования иммунохроматографической тест-системы «РЭД Helicobacter pylori » со штаммом 11б H. pylori .

Рис. 2. Результат тестирования иммунохро-матографической тест-системы «РЭД Helicobacter pylori » со штаммом 11б H. pylori

В предыдущих работах [Смирнова, Богачева, Дармов, 2018] мы уже говорили о том, что порог чувствительности иммунохроматографических тест-систем, определенный по биологической концентрации клеток в сравнении с таковой, определенной по оптической концентрации, может быть выше, и это может быть связано с тем, что антиген CagA H. pylori имеет внутриклеточную локализацию. В данной работе мы подтвердили наше утверждение, что если целевые антигены (белок CagA, уреаза и др.) расположены внутриклеточно, а не являются поверхностными антигенами целого корпускулярного микроорганизма, то о высокой чувствительности тест-системы можно говорить только при тестировании ее с коммерческим антигеном или с антигеном, предварительно выделенным из биологического материала, полученного от пациента.

При разработке тест-систем на поверхностные антигены бактерий трудностей с тестируемым материалом не возникает. Для тестирования подходят как чистая культура микроорганизма, так и биоматериал, полученный непосредственно от пациента (кал, мокрота, кровь). Чувствительность подобных тест-систем, например, для выявления Legionella pneumophila составляет 1×105 м.к.×см-3 [Ярков и др., 2009], Yersinia pseudotuberculosis – от 5×105 м.к.×см-3 [Богачева, Елагин, Печенкин, 2016].

В связи с этим при разработке иммунохромато-графических тест-систем, направленных на детекцию внутриклеточных патогенов, порог их чувствительности нельзя сравнивать с порогом чувствительности тест-систем, разработка которых направлена на детекцию поверхностных антигенов. Это обосновывает и тот факт, что большинство подобных тест-систем являются качественными, а не количественными.

Выводы

• 1.    Чувствительность иммунохроматографиче-ской тест-системы «РЭД Helicobacter pylori » («РЭД», Россия) при тестировании с коммерческим антигеном AGHPY-0100 («Arista Biologicals», США), в состав которого входят внутриклеточные белки H. pylori , ассоциированные с генами cagA, vac A, уреазой, оказалась высокой и составила не менее 20 нг/мл.

• 2.    Чувствительность иммунохроматографиче-ской тест-системы «РЭД Helicobacter pylori » («РЭД», Россия), предназначенной для выявления уреазы H.pylori , с целым инактивированным корпускулярным микроорганизмом, оказалась низкой, и составила 1.1×10¹⁰ м.к.×см^-3.

• 3.    На примере оценки иммунохроматографиче-ской тест-системы, предназначенной для выявления H. pylori , обоснована особенность чувствительности иммунохроматографического анализа в зависимости от локализации детектируемого антигена: у иммунохроматографических тест-систем, направленных на детекцию внутриклеточных патогенов, порог их чувствительности нельзя сравнивать с порогом чувствительности тест-систем, разработка которых направлена на детекцию поверхностных антигенов. В первом случае – это в большей степени качественные, а, во втором – количественные иммунохроматографические тест-системы.

Авторы выражают глубокую благодарность фирме ООО «Российская экспресс диагностика» за предоставление тест-систем «РЭД Helicobacter pylori » для проведения исследований.