Образование биопленок штаммами стафилококка, выделенными из различного биологического материала при инфекционных осложнениях тотального эндопротезирования коленного сустава

¹Введение. Имплантат-ассоциированная инфекция остается актуальной проблемой в травматологии и ортопедии, что связано с постоянным ростом числа эндопротезирований крупных суставов, большими материальными затратами на лечение инфекционных осложнений, высокой инвалидизацией пациентов [1, 2]. По данным регистра эндопротезирования коленного сустава РНИИТО им. Р. Р. Вредена, в 2011–2014 гг. доля ревизионного эндопротезирования коленного сустава на фоне развития глубокой имплантат-ассоции-рованной инфекции составила более 59% [1].

Длительное время основными возбудителями инфекционных осложнений после эндопротезирования крупных суставов считали коагулазоположительные стафилококки, особенно S. aureus , обладающие большим количеством известных факторов патогенности и вирулентности [3–5]. В последнее десятилетие пересмотрены представления о патогенезе имплантат-ассоциированной инфекции, и главная роль отводится способности возбудителя инфекции, как высокопатогенного, так и низкопатогенного, формировать биопленки, что рассматривается как основной фактор вирулентности [4–6]. Отдельное внимание уделяется взаимосвязи способности микроорганизмов к формированию биопленок и их резистентности к метициллину; многими авторами проводится активное изучение штаммов S. epidermidis , относящихся к клональному комплексу CC2 и являющихся носителями кассет SCCmec, детерминирующих устойчивость к метициллину и способных активно формировать биопленки [6].

Накопление бактериальной массы в виде биопленки на поверхности имплантатов и дальнейшая диссеминация микроорганизмов приводят к формированию хронического инфекционного процесса и необходимости удаления эндопротеза. Рядом исследователей доказано, что до 90% нозокомиальных инфекций связано с образованием биопленок и L-форм бактерий, устойчивых к антибиотикам, факторам иммунитета, неблагоприятным факторам внешней среды [4, 6]. В состав биопленок входят бактерии с замедленным метаболизмом, которые при недостатке питательных веществ переходят в некультивируемое состояние, что существенно затрудняет микробиологическую диагностику.

Для раннего выявления инфекционно-воспалительных осложнений после эндопротезирования и дифференциальной диагностики имплантат-ассо-циированной инфекции и асептического воспаления необходима обоснованная система микробиологической диагностики, учитывающая патогенетические особенности процесса, что требует пересмотра методологического подхода к микробиологической диагностике, применения информативных методов микробиологической диагностики, способных обнаруживать возбудителя в сессильной форме.

Цель: исследовать способность к биопленкообра-зованию в условиях in vitro штаммов Staphylococcus spp . — возбудителей имплантат-ассоциированной инфекции у пациентов после эндопротезирования коленного сустава в зависимости от исследуемого биологического материала.

Материал и методы . Проведен анализ результатов изучения способности к биопленкообразованию клинических штаммов стафилоколокка, выделенных из различных видов биологического материала, полученного от пациентов с перипротезной инфекцией после тотального эндопротезирования коленного сустава . В исследование включены 156 пациентов, проходивших лечение в НИИТОН СГМУ им. В. И. Разумовского в 2016–2018 гг. Исследованию подлежали: отделяемое ран и свищей, аспираты коленного сустава, гомогенизированные биоптаты мягких тканей перипротезной области, удаленные компоненты эндопротезов. Всего выделено 275 штаммов стафилококка (видовой состав и чувствительность к метициллину исследуемых штаммов см. в табл. 1).

Группу сравнения составили референс-штаммы S. epidermidis (АТСС 12228) и S. aureus (АТСС 25923, MRSA 43300).

Таблица 1

Эпидемиологическая характеристика исследуемых штаммов

Биологический материал	Штаммы Staphylococcus spp ., включенные в исследование
	S. aureus , n=121		S. epidermidis , n=154		Всего
	MSSA	MRSA	MSSE	MRSE
Отделяемое ран и свищей	14	16	26	19	75
Аспират	11	18	19	11	59
Биоптаты мягких тканей	12	21	21	20	74
Соникационная жидкость	12	17	19	19	67
Всего	49	72	85	69	275

П р и м еч а н и е : MSSA — метициллинчувствительные штаммы S. aureus; MRSA –метициллинрезистентные штаммы S. aureus; MSSE — метициллинчувствительные штаммы S. epidermidis; MRSE — метициллинрезистентные штаммы S. epidermidis.

На этапе дооперационной диагностики осуществляли взятие материала из поверхностных ран и свищей с помощью стерильных тампонов Transportswab (Citoswab) и пункцию коленного сустава для получения аспирата, что входит в стандартный протокол предоперационного обследования.

Интраоперационно проводили взятие тканевых биоптатов, не менее 3–5 точек для каждого пациента, общим объемом около 1 см3 в стерильные контейнеры. Биоптаты взвешивали, гомогенизировали, готовили разведение биоматериала изотоническим раствором NaCl, мерно высевали на плотные питательные среды.

Для деструкции биопленки при исследовании компонентов удаленных эндопротезов проводили их ультразвуковую обработку с целью получения взвеси сессильных бактериальных клеток для дальнейшего культурального исследования. Бактериологическое исследование фрагментов эндопротеза осуществляли следующим образом: удаленные фрагменты в операционной помещали в стерильный пакет и доставляли в лабораторию. В пакет добавляли 50–100 мл стерильного изотонического раствора, затем помещали в ванну ультразвуковой установки «УЗУМИ-2», заполненную водой. Обработку ультразвуком проводили в течение 10 минут при частоте 37 кГЦ. Затем соникационную жидкость мерно высевали на жидкие и плотные питательные среды для культурального исследования.

Микробиологическое исследование проводили по стандартным методикам с использованием дифференциально-диагностических и селективных сред. Для идентификации до вида использовали бактериологический анализатор Crystal Autoreader (Becton Dickinson).

Определение чувствительности к антибиотикам проводили диско-диффузионным методом согласно МУК 4.2.1890–04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» с использованием Mueller-Hinton-Agar (Becton Dickinson) и сенси-дисков (Becton Dickinson). Детекцию метициллинорезистентности осуществляли с использованием набора «MeReSa Agar Base, MRSA Alert» (Hi Media).

Биопленки моделировали статическим способом в полистироловых 96-луночных планшетах по методу G. D. Christensen [7]. Суточную агаровую культуру штаммов Staphylococcus spp . разводили 0,9%-м раствором NaCl до оптической плотности 0,5 McFarland с помощью денситометра Densi-La-Meter (Pliva-Lachema Diagnostika), затем разбавляли в 20 раз изотоническим раствором. Микробную взвесь в конечной концентрации 5^10 6 КОЕ/мл вносили по 100 мкл в лунки стерильных 96-луночных микропланшетов, добавляли 100 мкл ГРМ-бульона с глюкозой.

Во все серии экспериментов включали референтные штаммы S. aureus АТСС 25923 и S. epidermidis АТСС 12228 для оценки воспроизводимости результатов. Лунки с жидкой питательной средой без добавления микробной взвеси использовали в качестве отрицательного контроля. Для всех контрольных и опытных лунок соблюдали 4-кратные повторности.

Планшеты закрывали крышками и инкубировали при 37°С в течение 24 часов. В часть лунок добавляли только 200 мкл бульона без добавления бактериальной взвеси. Дальнейшие этапы для контрольных лунок были аналогичными опытным.

Питательную среду с планктонной формой бактерий удаляли, трехкратно промывали лунки 0,9%-м раствором NaCl. Для окрашивания образовавшейся биопленки в каждую лунку добавляли 100 мкл 0,1%-го водного раствора генцианвиолета на 20 минут при комнатной температуре. Краситель, который не связался с биопленкой, удаляли трехкратной промывкой планшета изотоническим раствором. Затем в каждую лунку вносили по 200 мкл 95%-го этанола для элюации связавшегося с образовавшейся биопленкой генцианвиолета. Оптическую плотность элюатов, которая отражала интенсивность образования биомассы биопленки, определяли на спектрофотометре Anthos 2020 при длине волны 540 нм.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программы Statistica 10.0. Проверку вариационных рядов на нормальность распределения выполняли по критерию Шапиро — Уилка. При статистическом анализе использовали непараметрические методы исследования с вычислением средней (M), стандартного отклонения средней (±SD), медианы (Me), 25-го и 75-го квартилей (Q). Для сравнения четырех выборок (отделяемое ран, аспираты, биоптаты, соникационная жидкость) использовали непараметрический дисперсионный анализ Краскела — Уоллиса. Для сравнения двух независимых выборок использовали тест Колмогорова — Смирнова. Различия считали значимыми при p<0,05.

Результаты . Проведено эпидемиологическое исследование клинических штаммов в зависимости от источника их выделения. Из отделяемого ран и свищей выделено 75 штаммов Staphylococcus spp . (27,3% от общего количества выделенных штаммов); из аспирата — 59 штаммов стафилококка (21,4%), из биоптатов мягких тканей — 74 штамма (26,9%); из соникационной жидкости — 67 штаммов Staphylococcus spp . (24,3%). Резистентность к метициллину выявлена у 51,2% всех штаммов, причем среди коагулазоположительных стафилококков она была достоверно (p<0,05) выше (60,5%), чем у коагулазонегативных (44,8%). Данные по видовому составу и метициллинрезистентности штаммов, выделенных из различных видов биологического материала, представлены в табл. 1.

Проводили оценку способности формирования биопленок штаммами стафилококка статическим методом культивирования, который предполагает измерение оптической мутности элюатов генцианвиолета в 96-луночном планшете.

Для референс-штаммов S. aureus АТСС 25923 и S. epidermidis АТСС 12228 значения оптической плотности экстрактов генцианвиолета составили 0,211 (0,189; 0,234) и 0,189 (0,152; 0,214) соответственно.

Проведено исследование оптической плотности экстрактов генцианвиолета, полученных из клинических штаммов Staphylococcus spp ., отличающихся по виду, резистентности к метициллину и источнику выделения; результаты представлены в табл. 2.

Выявлено, что у элюатов из штаммов стафилококка, выделенных из поверхностных ран и свищей, значения оптической плотности экстрактов красителя достоверно (p<0,05) ниже, чем у штаммов, выделенных из биоптатов мягких тканей и из сони-кационной жидкости, что отражает слабую способность к пленкообразованию данной группы штаммов. У штаммов, выделенных из аспиратов, отмечали самые низкие значения оптической плотности экстрактов, достоверно не отличающиеся от значений референсных штаммов, что также свидетельствует

Таблица 2

Оптическая плотность экстрактов генцианвиолета, полученных из клинических штаммов Staphylococcus spp. и референс-штаммов

Биологический материал	Оптическая плотность экстрактов генцианвиолета для различных групп Staphylococcus spp .
	S. aureus		S. epidermidis
	MSSA, n=49	MRSA, n=72	MSSE, n=85	MRSE, n=69
Отделяемое ран и свищей	0,199 (0,156; 0,318)	0,332 (0,232; 0,398)	0,185 (0,162; 0,298)	0,309 (0,175; 0,432)
Аспират	0,156 (0,085; 0,179)	0,202 (0,178; 0,269)	0,195 (0,155; 0,256)	0,117 (0,092; 0,258)
Биоптаты мягких тканей	0,601 (0,465; 0,723) P3-1=0,027 P3-2=0,002	0,562 (0,511; 0,624) P3-1=0,027 P3-2<0,001	0,893 (0,742; 0,950) P3-1=0,014 P3-2<0,001	1,103 (0,969; 1,331) P3-1=0,002 P3-2<0,001
Соникационная жидкость	1,016 (0,966; 1,141) P4-1<0,001 P4-2<0,001	1,267 (1,178; 1,431) P4-1<0,001 P4-2<0,001 P4-3<0,001	1,388 (1,104; 1,616) P4-1<0,001 P4-2<0,001 P4-3<0,001	1,563 (1,056; 1,892) P4-1<0,001 P4-2<0,001

Примечание: в таблице приведены значения медианы и квартилей (25%; 75%); Р3-1 — статистически различия между штаммами, выделенными из биоптатов, и штаммами, полученными из отделяемого ран; P3–2 — статистические различия между штаммами из биоптатов и штаммами, полученными из аспиратов; P4–1 — статистические различия между штаммами из соникационной жидкости и штаммами из отделяемого ран; P4–2 — статистические различия между штаммами, полученными из соникационной жидкости, и штаммами из аспирата; P4–3 — статистические различия между штаммами из соникационной жидкости и из биоптатов.

о слабой пленкообразущей способности этой группы изолятов (рис. 1, 2).

Штаммы стафилококка, выделенные из биопта-тов мягких тканей, характеризовались высокими значениями оптической плотности элюатов красителя, достоверно (p<0,05) превышающими показатели штаммов 1-й группы (отделяемое ран), 2-й группы (аспираты) и референс-штаммов, что позволяет говорить о склонности данных штаммов формировать биопленки. Максимальные значения оптической плотности экстрактов генцианвиолета, достоверно (p<0,05) отличающиеся от 1-й и 2-й групп, отмечены среди штаммов, выделенных из соникационной жидкости (см. рис. 1, 2).

Cравнительный межвидовой анализ способности S. epidermidis и S. aureus формировать биопленки не выявил статистически достоверных различий способности к пленкообразованию при анализе штаммов, полученных из отделяемого ран, аспиратов, из соникационной жидкости (рис. 3).

Межвидовые различия отмечены только у группы штаммов, выделенных из биоптатов: оптическая плотность экстрактов штаммов S. epidermidis была достоверно (p<0,05) выше, чем у штаммов S. aureus (см. рис. 3).

Обсуждение. Проведено исследование способности штаммов Staphyloccus spp., выделенных у пациентов с имплантат-ассоциированной инфекцией после эндопротезирования коленного сустава, к формированию биопленок в зависимости от вида исследуемого биологического материала, которое выявило достоверные различия способности к плен-кообразованию у различных групп стафилококка.

Штаммы, выделенные из соникационной жидкости, полученной после ультразвуковой обработки удаленных компонентов эндопротезов, и из биопта-тов мягких тканей, характеризовались высокой способностью к формированию биопленок, достоверно (p<0,05) отличающейся от штаммов, выделенных из поверхностных ран и аспирата. По данным неко-

А)

Рис. 1. Статистические различия оптической плотности экстрактов красителей штаммов S. epidermidis, выделенных из различного биологического материала:

А ) MSSE; Б ) MRSE

Диаграмма размаха MRSE

материал                         * Крайние точки

Б)

Рис. 3. Межвидовые различия способности S. aureus ( 1 ) и S. epidermidis ( 2 ) к пленкообразованию

Диаграмма размаха

биоматериал                          * Крайние точки

А)

Б)

Рис. 2. Статистические различия оптической плотности экстрактов красителей штаммов S. aureus , выделенных из различного биологического материала:

А ) MRSA; Б ) MSSA

торых исследователей, более интенсивное биоплен-кообразование у этих групп штаммов обусловлено неблагоприятными условиями внешней среды, недостатком кислорода, наличием абиогенных поверхностей компонетов эндопротеза. Все это приводит к активации биопленкообразования как защитного механизма, позволяющего микроорганизмам сохранить жизнеспособность. Рядом авторов показано, что существует избирательная адгезия микробов к имплантату: у штаммов S. epidermidis она активнее происходит к полимерным частям эндопротеза, у штаммов S. aureus — к металлическим [6, 8], однако наши исследования не обнаружили подобной тенденции. Следует учитывать, что и коагулазоположительные, и коагулазоотрицательные виды стафилококка могут активно взаимодействовать с белками организма (фибронектин, фибриноген, коллаген), которые покрывают конструкции эндопротеза немедленно после их имплантации [9], поэтому различия в тропности разных видов стафилококка к различным абиотическим материалам могут отсутствовать.

Штаммы стафилококка, выделенные из поверхностных ран и аспирата, характеризовались достоверно (p<0,001) меньшей способностью в био-пленкообразованию, чем штаммы, выделенные из биоптатов мягких тканей и из соникационной жидкости. Данная закономерность может быть объяснена преобладанием планктонных форм бактерий в минимальном количестве в аспиратах и отделяемом поверхностных ран, с чем связана низкая информативность дооперационной бактериологической диагностики имплантат-ассоциированной инфекции. Биопленка, сформированная на поверхности эндопротеза с прочно фиксированными микроорганизмами, является основным патогенетическим фактором инфекционного процесса и может быть выявлена при исследовании других видов биологического материала — соникационной жидкости и гомогенизированных биоптатов мягких тканей.

Некоторые авторы указывают на более активное биопленкообразование у штаммов эпидермального стафилококка, особенно выделенных из соникаци-онной жидкости и мягких тканей [10], однако достоверные (p<0,05) межвидовые различия между интенсивностью пленкообразования между штаммами S. aureus и штаммами S. epidermidis выявлены только у штаммов, выделенных из биоптатов. При изучении всех других типов биологического материала видовые различия в способности формировать биопленки не обнаружены.

Заключение. Способность к формированию биопленок выявлена у 51,2% исследуемых штаммов, причем среди коагулазоположительных стафилококков она была достоверно (p<0,05) выше, чем у коагулазонегативных.

Штаммы стафилококка, выделенные из соника-ционной жидкости, полученной после ультразвуковой обработки удаленных компонентов эндопротезов, и из биоптатов мягких тканей, характеризовались высокой способностью к формированию биопленок, достоверно (p<0,05) превышающей значения штаммов, выделенных из поверхностных ран и аспирата.

Межвидовые различия отмечены только у группы штаммов, выделенных из биоптатов: оптическая плотность экстрактов штаммов S. epidermidis была достоверно (p<0,05) выше, чем у штаммов S. aureus .

Таким образом, способность к биопленкообразо-ванию у штаммов стафилококка, выделенных от пациентов с имплантат-ассоциированной инфекцией, зависит от исследуемого биологического материала, что определяет наиболее информативные методы микробиологического исследования, позволяющие выявить инфекционные осложнения эндопротезирования крупных суставов и идентифицировать их этиологический фактор.