Обзор аппаратных средств для систем визуализации флуоресценции живых организмов

Автор: Кодирова О.Ю., Кодирова В.Н.

Журнал: Теория и практика современной науки @modern-j

Рубрика: Основной раздел

Статья в выпуске: 1 (43), 2019 года.

Бесплатный доступ

В данной статье освещено обзор аппаратных средств, необходимых для систем визуализации флуоресценции живых организмов.

Аппарат, лазер, живых организм

Короткий адрес: https://sciup.org/140273880

IDR: 140273880

Текст научной статьи Обзор аппаратных средств для систем визуализации флуоресценции живых организмов

Оптические технологии клеточной и молекулярной прижизненной визуализации на сегодняшний день становятся все более востребованными инструментами. Наиболее перспективными технологиями являются флуоресцентный и биолюминесцентный имиджинг, при котором животным имплантируются    опухоли,    меченные    флуоресцентными    или биолюминесцентными агентами. Проблема состоит в том, что для исследования этих имплантированных опухолей, для наблюдения их роста в живом организме и их регресса в ходе терапии, а также оценки эффективности новых противоопухолевых препаратов до сих пор не существует оптимальных устройств, которые сочетали бы в себе высокую информативность, надежность и относительно низкую стоимость.

Одним из актуальных направлений в медицине является разработка новых эффективных противоопухолевых препаратов. Их интенсивные поиски ведутся во многих странах мира. До испытания в клинике каждый противоопухолевый препарат проходит предклиническую апробацию. Его фармакологическое действие и токсические свойства детально определяются на моделях опухолей мелких лабораторных животных, как правило, мышей. Однако для проведения тканевого или молекулярного анализа необходимо умерщвлять животное, что не позволяет наблюдать изучаемый процесс in vivo. В этой связи, оптические технологии клеточной и молекулярной визуализации становятся все более востребованными инструментами для получения данных о биохимических, генетических и фармакологических процессах in vivo. Наиболее перспективными оптическими технологиями для предклинических исследований являются флуоресцентный имиджинг, при котором животным имплантируются опухоли, меченные флуоресцентными агентами. Обзор коммерчески доступных систем флуоресцентной визуализации показывает, что существует несколько широко применяемых технологий флуоресцентного биоимиджига и большое разнообразие инструментов для отображения данных. Выбор обусловлен такими факторами, как стоимость, необходимые типы данных, простота использования, возможность объединения с другими системами визуализации, например, для мультимодального имиджинга.

Из-за сложного характера распространения света в ткани конфигурация системы визуализации флуоресценции имеет решающее значение, так как, в конечном счете, она определяет информативность изображения. Изображение строится на основе излучения, отраженного от исследуемого объекта, или прошедшего сквозь. В первом случае источник и приемник находятся по одну сторону от объекта, во втором — в конфигурации «на просвет», т. е. освещение ткани производится с одной стороны, а регистрация света, прошедшего через ткань, с другой. Каждый из методов обладает рядом преимуществ и является оптимальным для решения различных биологических задач [1].

Все in vivo системы визуализации флуоресценции разработаны вокруг идеи, что часть спектра эмиссии флуоресцирующей молекулы может быть спектрально отделена от возбуждающего излучения, а при наличии фонового освещения, еще и от него. Это достигается, прежде всего, с помощью спектральной фильтрации оптического излучения, возможности которой в результате будут диктовать нижний предел обнаружения флуорофоров. Существуют также другие способы, например, с помощью временного разделения возбуждающего излучения и отложенной флуоресценции. При этом оптический регистратор остается закрытым до конца зондирующего импульса и открывается лишь после его окончания. Время релаксации флуоресцентных белков составляет всего лишь 1–3 нс, т.е. время срабатывания электронного затвора должно быть на уровне долей наносекунды, а длительность возбуждающего излучения не превышать 0.5 нс. Для реализации такого подхода должны использоваться дорогие лазерные источники света и высокоскоростные электронно-оптические компоненты (камеры с фотокатодом на микроканальных пластинах, стрик-камеры, время-кореллированные счетчики фотонов). Для спектрального отделения автофлуоресценции от флуоресценции биомаркера необходимо детально измерять спектр флуоресценции, для чего может быть использована серия сменных интерференционных фильтров с различными полосами пропускания, дифракционные решетки, жидкокристаллические или акустооптические перестраиваемые фильтры. Кроме того, спектральные данные также могут служить основой для визуализации нескольких флуорофоров одновременно с использованием технологии спектрального разделения сигналов флуоресценции.

Существует широкий спектр источников света, с помощью которых можно достичь возбуждения флуоресценции, включая лампы накаливания и газоразрядные лампы (вольфрамовые и ксеноновые), светоизлучающие диоды, любые лазерные системы, в том числе газовые, кристаллические и диодные лазеры. С точки зрения количества доступных длин волн могут быть использованы универсальные инструменты, такие как перестраиваемые лазеры (например, титан-сапфировый лазер).

Возможно использование относительно недорогих ламп накаливания со сплошным спектром в видимом диапазоне длин волн и большим выбором фильтров для различных длин волн возбуждения. Но изотропное излучение ламп ограничивает возможность сосредоточить большое количество энергии на поверхности ткани. Лампы также требуют относительно длительного времени прогрева и значительно менее стабильны и долговечны, чем полупроводниковые устройства. Изменения интенсивности лампы могут быть в диапазоне 10–50 % в течение времени отображения, тогда как стабильность диодных лазеров, как правило, может быть в диапазоне 0.1 %. Наконец, системы с лампами не подходят для измерений во временной и частотной областях, которые требуют точной и быстрой модуляции интенсивности источника. Светодиоды (LED) и лазерные диоды (LD) обладают высокой стабильностью. LD идеально подходят для фокусировки в конфигурации растрового сканирования. Лазерные диоды и светодиоды доступны только для дискретных или относительно узких диапазонов длин волн, поэтому системы, способные к возбуждению флуорофоров с различными длинами волн возбуждения, требуют несколько диодных устройств. Это может увеличить стоимость системы, особенно, если требуется охлаждение диодов.

Последние - безусловно, самые чувствительные инструменты и предлагают исключительный динамический диапазон, но поскольку они являются точечными регистраторами, то для получения двумерного изображения требуется слишком большое время и большое количество каналов.

Литературы:

Список литературы Обзор аппаратных средств для систем визуализации флуоресценции живых организмов

  • Каменский В. А., Орлова А. Г. Методы биоимиджинга. Программа курса: Учебно-методическое пособие. Н.Новгород: Нижегородский госуниверситет, 2010. - 33 с.
  • Leblond F., Davis S. C., Valdés P. A., Pogue B. W., "Pre-clinical whole-body fluorescence imaging: Review of instruments, methods and applications". Journal of photochemistry and photobiology. Biology, 2010. 98(1): pp. 77-94
Статья научная