Оценка активности антиоксидантных ферментов у представителей разных популяций Lymnaea stagnalis различается по степени заражения при температурном стрессе

Загрязнение водоемов, происходящее на фоне глобальных климатических изменений и повышенной антропогенной нагрузки, ведет к серьезным нарушениям в функционировании экосистем (Rogelj, 2013; IPCC, 2014). Возрастающая на пресные водоемы антропогенная нагрузка оказывает негативное воздействие на состояние их биоты, в том числе и на сообщества пресноводных легочных моллюсков – одной из доминантных групп макрозообентоса. При рассмотрении адаптационных механизмов загрязнение ведет к развитию стрессовых реакций у организмов, а на популяционном уровне - к снижению численности популяций многих видов, вплоть до их полного исчезновения (Fordham et al. , 2013; Golubev et al. , 2005, 2013).

Согласно определению Воробьевой Л.И. (2004), стресс – это любые изменения в геноме, протеоме или в окружающей среде, которые приводят к снижению скорости роста или способности к выживанию. Потому, на биохимическом уровне постоянное обитание гастропод в загрязнённых условиях ведет к локальным адаптациям и активации ряда как специфических, так и неспецифических механизмов стресс-резистентности (Lorenzo et al. , 2016).

Пресноводные легочные моллюски часто используются в качестве модельных объектов при проведении экологических и физиологических экспериментов (Jackson et al., 2016). Одним из наиболее распространенных и удобных объектов выступает вид Lymnaea stagnalis (Linnaeus, 1758). Данный вид широко распространен на территории Евразии и приспособлен к обитанию в водоемах с высокой степенью загрязнения и при различных температурных режимах.

Несмотря на то, что данный вид выступает модельным для изучения ряда экофизиологических механизмов стресс-адаптации (Axenov-Gribanov et al , 2015), вопросы влияния паразитических инвазий на биохимический статус гастропод и их механизмы стресс-адаптации остаются зачастую неизученными. В связи с этим целью настоящего исследования являлась оценка влияния острого температурного стрессового воздействия и и инвазированности личинками трематод на активность ферментов антиоксидантной системы (пероксидазы, каталазы и глутатион S-трансферазы) у некоторых популяций легочного моллюска L. stagnalis респ. Беларусь.

MATERIALS AND METHODS

В качестве объекта исследования были выбраны легочные моллюски Lymnaea stagnalis (Linnaeus, 1758). Моллюск встречается преимущественно в прибрежной полосе на илисто-песчаных грунтах и зарослях полупогруженной растительности (Maximova et al. , 2012).

Моллюски были собраны в двух водоёмах: в чистом озере Нарочь и в загрязненном Чижовском водохранилище р. Свислочь. В ходе экспериментального исследования проведена экспозиция гастропод в условиях острой гипертермии при температуре +35°С. Пробоотборы мышечной ткани особей проводились через каждые 4 часа экспозиции. Длительность экспериментов составила 24 часа. Как для контрольный, так и для экспериментальной выборки был проведён паразитологический анализ пищеварительной железы моллюсков на наличие трематод (Kiatsopit et al., 2016), а так же определена активность некоторых ферментов антиоксидантной системы (пероксидазы, глутатион S-трансферазы и каталазы).

Оценку активности ферментов антиоксидантной системы (пероксидазы, каталазы и глутатион S-трансферазы) проводили согласно модифицированным (Timofeyev et al. , 2006., Bedulina et al. , 2010) спектрофотометрическим методикам Drotar (1985), Aebi (1984) и Habig (1974). Измерения проводили на спектрофотометре Cary 50 (Varian, США) при λ=436 нм для пероксидазы, при λ=240 нм для каталазы и при λ=340 нм для глутатион S-трансферазы. Все эксперименты проведены в 5 биологических параллелях. Биохимический анализ каждой пробы проведен в 3-х аналитических измерениях. Оценку достоверности проводили, используя U-критерий Манна - Уитни. Статистический анализ проводили с использованием программы Past 3.12.

RESULTS AND DISCUSSION

Результаты оценки влияния паразитарной инвазии на активность механизмов неспецифической стресс-резистентности при температурно-индуцированном стрессовом воздействии представлены на рисунках 12.

При оценке направленностей стресс-реакций по изменению активности ферментов антиоксидантной системы у инвазированных и неинвазированных представителей L. stagnalis при действии острой гипертермии (35°С) были обнаружены как сходства, так и отличия. Так, у неинвазированных особей, обитающих в Чижовском водохранилище отмечали кратковременное повышение активности каталазы с 79.38±17.79 нКат/мг белка до 122.23 ±10.28 нКат/мг белка через 4 часа экспозиции (рис. 1В). При этом у инвазированных трематодами особей изменения активности каталазы не наблюдали.

Повышение активности каталазы так же наблюдали у неинвазированных моллюсков, отловленных в оз. Нарочь после 8 и 24 часов экспозиции при повышенных температурах (Рис. 2В). Так, активность фермента повышалась с 57.44 ±13.67 нКат/мг белка до 84.42 ±8.9 нКат/мг белка и 93.88 ±15.23 нКат/мг белка соответственно. При этом у инвазированных трематодами особей изменения активности каталазы не наблюдали.

В ходе температурного стрессового воздействия активность глутатион S-трансферазы не изменялась как у инвазированных, так и у неинвазированных особей, собранных в чистом оз. Нарочь (Рис. 2Б). В то же время у представителей L. stagnalis, собранных в загрязненном Чижовском водохранилище, отмечали кратковременное повышение активности глутатион S-трансферазы у неинвазированных особей (Рис. 1Б). Повышение активности фермента отмечали спустя 8 и 16 часов эксперимента с 6.28 ±0.32 нКат/мг белка до 7.25 ±0.68 нКат/мг белка и 8.54 ±1.57 нКат/мг белка соответственно. В то же время изменений активности данного фермента у инвазированных особей не наблюдали. Повышение активности глутатион S-трансферазы может косвенно указывать на накопление продуктов перекисного окисления липидов и функциональную перестройку клеточных мембран, что свидетельствует об усилении выведения поддержания целостности мембран (Le Pennec, 2003).

продуктов перекисного окисления липидов и

IM

контроль 1ч 4ч 8ч 12ч     16ч     20ч     24ч

Figure 1. Оценка активности ферментов АОС (в нКат/мг белка) в мышечной ткани у представителей L. stagnalis , обитающих в Чижовском водохранилище, отличающихся по своей зараженности личинками трематод при температурно-индуцированном стрессе (А-пероксидаза; Б-глутатион S-трансфераза; В-каталаза)

Figure 2. Оценка активности ферментов АОС (в нКат/мг белка) в мышечной ткани у представителей L. stagnalis , обитающих в оз. Нарочь, отличающихся по своей зараженности личинками трематод при температурно-индуцированном стрессе (А-пероксидаза; Б-глутатион S-трансфераза; В-каталаза)

Активность пероксидазы показала более отличную картину между анализируемыми выборками. При температурной экспозиции активность фермента статистически значимо не изменялась в ходе всего эксперимента у инвазированных особей, собранных в оз. Нарочь (Рис. 2А) и у инвазированных представителей, собранных в Чижовском водохранилище (Рис. 1А). Однако отмечали кратковременное понижение активности фермента у неинвазированных обитателей озера Нарочь и

Чижовского водохранилища через 1 час (с 0.4 ±0.17 нКат/мг белка до 0.22 ±0.22 нКат/мг белка) и 4 часа (с 0.26 ±0.092 нКат/мг белка до 0.06 ±0.095 нКат/мг белка) после начала эксперимента соответственно.

В ходе проведенного исследования показано, что при экспериментальной гипертермии у незараженных L. stagnalis повышается активность каталазы и глутатион S-трансферазы, однако снижается активность пероксидазы. Одним из механизмов воздействия температурного фактора на организм гидробионтов является активация их метаболических процессов. Поскольку метаболизм гидробионтов зачастую зависит от температурных изменений в окружающей среде, повышение температуры среды обитания приводит к активации их метаболизма вместе с увеличением потребления кислорода и, соответственно, к окислительному повреждению клеток и клеточных структур, за счет накопления активных форм кислорода (супероксидного аниона, перекиси водорода, гидроксильного радикала в среде и прочих свободных радикалов) (Sies, 2013; Schieber & Chandel, 2014). В ряде экспериментов показано, что повышение температуры ведет к активации упоминаемых ферментов, что свидетельствует о развитии окислительного стресса и активации защитных механизмов неспецифической стресс-адаптации (Tomanek & Zuzow, 2010; Sokolova et al. , 2011; Dimitriadis et al. , 2012).

Изменение активности ферментов антиоксидантной системы указывают на нарушение системы контроля за эндогенно образованными активными формами кислорода. Повышение активности пероксидазы и каталазы при температурном стрессовом воздействии указывает на активацию антиоксидантной системы и утилизацию активных форм кислорода и свободно-радикального окисления (Abele et al., 2011; Freire et al., 2011; Lushchak, 2011). Наблюдаемое же снижение активности ферментов, показанное в случае экспозиции при повышенных температурах у неинвазированных особей, отловленных из обоих водоёмов, может быть связано с сохранением энергетического гомеостаза и снижением метаболической и функциональной активности (de Jong-Brink et al., 2001).

ACKNOWLEDGEMENTS

Работа выполнена в рамках Задания № 5.3.14 Государственной программы научных исследований Республики Беларусь «Химические технологии и материалы, природно-ресурсный потенциал», а также при частичной финансовой поддержке проектов МИНОБРНАУКИ РФ (ГЗ 1354 -2014/51), РНФ (14-1400400), CRDF (FSCX-15-61168-0), РФФИ (14-0400501, 15-54-04062, 16-34-60060) и ФГБОУ ВО «ИГУ».