Оценка активности ферментов антиоксидантной системы в популяциях сосны обыкновенной Чернобыльской зоны отчуждения

В настоящее время всё больший интерес приобретает оценка воздействия облучения на живые организмы на участках с повышенным радиационным фоном. Такими участками являются обширные лесные территории, загрязнённые в результате крупных радиационных аварий на ПО «Маяк» (1957 г.) и на Чернобыльской АЭС (1986 г.). Влияние ионизирующего излучения на высшие растения представляет интерес в первую очередь для сельского хозяйства и экологии. Несмотря на важную роль, которую играют растения в современной биосфере, воздействие ионизирующего излучения на растения изучено гораздо хуже, чем на млекопитающих [1]. Ещё одна проблема связана с тем, что подавляющее большинство имеющейся в научной литературе информации об ответных реакциях растений на облучение получено в условиях контролируемых лабораторных и вегетационных экспериментов с высокими уровнями облучения. Полученная в полевых условиях информация о последствиях хронического облучения в популяциях растений носит фрагментарный характер, что связано со сложностью проведения и интерпретации результатов полевых исследований. Существенным доводом в пользу проведения полевых исследований является несоответствие между лабораторными тестами и полевыми данными, полученными на представителях биоты, обитающих в условиях хронического облучения [2]. В реальном мире на растения воздействует множество факторов разной природы, что невозможно учесть в рамках лабораторных исследований. Территория зоны отчуждения ЧАЭС, в рамках которой уровни радиоактивного загрязнения не формируют летальных доз, позволяет изучить отдалённые последствия хронического облучения для популяций растений. Анализ ответа антиоксидан-

Смирнова А.С. – мл. науч. сотр.; Ханова А.С. – науч. сотр..; Гераськин С.А.* – зав. лаб., д.б.н., проф. НИЦ «Курчатовский институт» – ВНИИРАЭ.

тных ферментов растений на низкодозовое хроническое облучение имеет большое значение для расширения наших представлений о механизмах адаптации растений к изменениям окружающей среды. Целью данной работы является оценка активности ферментов антиоксидантной системы в популяциях сосны обыкновенной, подвергающихся хроническому радиационному воздействию в Чернобыльской зоне отчуждения.

Материалы и методы

Объект исследования. Объектом исследования были выбраны популяции сосны обыкновенной ( Pinus sylvestris L.). Сосна обыкновенная обладает высокой радиочувствительностью и повсеместно распространена на территориях, загрязнённых в результате аварии на ЧАЭС, что делает её перспективным объектом для проведения исследований эффектов хронического облучения.

Экспериментальные участки и пробоотбор. Экспериментальные участки (Гнездинка, Масаны и Кулажин) расположены в Белорусском секторе Чернобыльской зоны отчуждения и характеризуются контрастным уровнем и составом радиоактивного загрязнения. Контрольные участки Рудинка 1 и Рудинка 2 находятся в Козелужском лесничестве Хойникского лесхоза. Мощности поглощённой в хвое дозы приведены в табл. 1. Подробное описание экспериментальных участков и методов оценки поглощённой растениями дозы приведены в работе [3].

Таблица 1

Мощность поглощённой в хвое дозы на экспериментальных участках [3]

Пробоотбор был проведён в мае и ноябре 2023 г. Для этого с 10-11 деревьев на каждом участке отбирали двухлетнюю хвою на высоте 12-16 м от земли и сразу фиксировали в жидком азоте.

Определение активности супероксиддисмутазы. Активность супероксиддисмутазы (SOD, КФ 1.15.1.1) определяли по ингибированию фоторедукции нитросинего тетразолия с помощью супероксидных радикалов, которые образуются при автоокислении рибофлавина в присутствии метионина и ЭДТА [4]. Методика была модифицирована.

Для анализа отбирали навеску хвои 0,05 г и гомогенизировали в жидком азоте с добавлением поливинилпиролидона (PVP). Гомогенат суспендировали в холодном 0,1 М калий-фосфатном буфере (pH=7,8) и центрифугировали в течение 20 мин при скорости 14500 об./мин на центрифуге с охлаждением (Eppendorf, Германия). Реакционную среду готовили последовательным смешением 490 мкл калий-фосфатного буфера, 100 мкл 1 мМ раствора ЭДТА, 100 мкл 1% раствора тритона Х-100, 100 мкл 0,13 М раствора метионина, 100 мкл 0,8167 мМ раствора нитроси-него тетразолия. Далее добавляли 100 мкл супернатанта. Реакцию запускали добавлением 10 мкл 0,58 мМ раствора рибофлавина и сразу помещали в условия освещения. По истечении 10 мин помещали пробирки в темноту, останавливая реакцию. Оптическую плотность измеряли на бескюветном спектрофотометре NanoDrop-2000 (Thermo Fisher Scientific, США) при длине волны 560 нм. Расчёт активности фермента проводили по формуле:

_Г-!!^4_Оо%,                                              (1)

^к где Ак и Аоп – экстинкции контрольной и опытной проб.

За единицу активности супероксиддисмутазы считали такое количество фермента, которое снижает интенсивность окрашивания реакционной смеси на 50%.

Определение активности каталазы и аскорбатпероксидазы. Для оценки активности каталазы (CAT, КФ 1.11.1.6) и аскорбатпероксидазы (APX, КФ 1.11.1.11) из каждого образца отбирали навеску хвои, равную 0,1 г, и гомогенизировали в жидком азоте с добавлением поли-винилпирролидона (PVP). Осадок ресуспендировали в холодном 0,1 М калий-фосфатном буфере (рН=7,0) и центрифугировали в течение 20 мин при скорости 14500 об./мин на центрифуге с охлаждением (Eppendorf, Германия). Измерение проводили на бескюветном спектрофотометре NanoDrop-2000 (Thermo Fisher Scientific, США). Анализ активности каталазы проводили при длине волны 240 нм и коэффициенте экстинкции 8=4,0 x 10 3 л/моль^см [5]. Анализ активности аскорбатпероксидазы проводили при длине волны 290 нм и коэффициенте экстинкции 8=2,8 x 10 3 л/моль^см [6]. Показания спектрофотометра переводили в международные единицы ферментативной активности (МЕ) [5], используя формулу:

МЕ/мл =

ЛА/минхК реакц.смеси ,млхКоэф.Развед.х 1 О О О О

^nm (лхмоль 1хсм ЪхУфермента.мл где 4А - разность значений абсорбции; enm (л х моль 1 х см 1) - коэффициент поглощения.

Активность каталазы оценивали по динамике разложения перекиси водорода ферментом через 2 мин. Активность аскорбатпероксидазы оценивали по динамике окисления аскорбата ферментом через 1 мин.

Определение активности глутатионпероксидазы. Для оценки активности глутатионпероксидазы (GPX, КФ 1.11.1.9) из каждого образца отбирали навеску хвои, равную 0,1 г, и гомогенизировали в жидком азоте с добавлением поливинилпирролидона (PVP) [5]. Осадок ре-суспендировали в холодном 0,1 М TRIS-буфере. Затем гомогенаты центрифугировали в течение 20 мин при скорости 14500 об./мин на центрифуге с охлаждением (Eppendorf, Германия). Измерение проводили на спектрофотометре NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific, США). Анализ проводили по методике [7] с модификациями при длине волны 340 нм и коэффициенте экстинкции 6,22 x 10 3 л/молысм. Показания спектрофотометра переводили в международные единицы ферментативной активности (МЕ), используя формулу (2) [5]. Активность глутатионпероксидазы оценивали по динамике прохождения реакции до нагрева и после.

Статистическая обработка данных. Графическая визуализация полученных в результате исследования данных выполнена в MS Office Excel 2019. После отклонения гипотезы о нормальном распределении данных (тест Шапиро-Уилка) значимость различий оценивали с помощью непараметрического U-критерия Манна-Уитни в среде программирования Python версии 3.11. Результаты со значением p, меньшим или равным 0,05, были признаны статистически значимыми. Приближёнными к значимым результатам данные (тенденция к значимости) считали значения в диапазоне 0,05

Результаты и обсуждение

Активность супероксиддисмутазы. Активность SOD в хвое сосен, собранной в ноябре 2023 г. с загрязнённых участков Гнездинка и Кулажин, имела тенденцию к понижению (p=0,097; 0,076) в сравнении с контрольным участком Рудинка 1 (рис. 1Б). В хвое сосен, собранной в мае 2023 г., значимые отличия в активности данного фермента от контрольных значений не обнаружены (рис. 1А).

г ш

О ел

и

Рис. 1. Активность SOD в хвое сосен в зависимости

1:2

OS

0.6

0,4

0.2

О

Б

Руд1 Руд2 Гн Мас Кул Участок от участка: А – хвоя собрана в мае 2023 г.;

Б – хвоя собрана в ноябре 2023 г.; □ – различия имеют тенденцию к статистически значимым по сравнению с контролем Рудинка 1, p<0,1, U-тест.

Активность каталазы. Оценка активности каталазы в хвое сосен, собранной в мае и ноябре 2023 г., показала статистически значимые отличия между контрольными участками Ру-динка 1 и Рудинка 2 (p=0,008; 0,045) (рис. 2А, 2Б). Не обнаружено устойчивого изменения активности антиоксидантного фермента CAT в хвое сосен Чернобыльской зоны отчуждения в ответ на хроническое облучение, хотя наблюдается тенденция к снижению активности CAT на загрязнённых участках в ноябре.

ш юоо

от участка: А – хвоя собрана в мае 2023 г.;

Рис. 2. Активность CAT в хвое сосен в зависимости

Б – хвоя собрана в ноябре 2023 г.; ◊ – различия имеют тенденцию к статистически значимым по сравнению с контролем Рудинка 2, p<0,1, U-тест; * – различия статистически значимы по сравнению с контролем Рудинка 1, p<0,05, U-тест; † – различия статистически значимы по сравнению с контролем Рудинка 2, p<0,05, U-тест.

Активность аскорбатпероксидазы. Обнаружена тенденция к повышению (p=0,076) активности аскорбатпероксидазы в хвое, собранной в мае 2023 г. на участке Гнездинка, по сравнению с контрольным участком Рудинка 2 (рис. 3А); в хвое, собранной в ноябре 2023 г., обнаружена тенденция к снижению (p=0,076) активности аскорбатпероксидазы на участке Гнездинка по срав- нению с

от участка: А – хвоя собрана в мае 2023 г.,

Рис. 3. Активность APX в хвое сосен в зависимости

контролем Рудинка 1 (рис. 3Б).

Б – хвоя собрана в ноябре 2023 г.; □ – различия имеют тенденцию к статистически значимым по сравнению с контролем Рудинка 1, p<0,1, U-тест; ◊ – различия имеют тенденцию к статистически значимым по сравнению с контролем Рудинка 2, p<0,1, U-тест.

Активность глутатионпероксидазы. Активность GPX в хвое сосен, собранной в ноябре 2023 г. с загрязнённого участка Кулажин, значимо понижалась (p=0,042) и имела тенденцию к снижению (p=0,073) на участке Гнездинка в сравнении с контрольным участком Рудинка 1 (рис. 4Б). В хвое, собранной в мае 2023 г., значимых отличий активности данного фермента от контрольных значений не обнаружено (рис. 4А).

О

0,006

0.008

Рис. 4. Активность GPX в хвое сосен в зависимости от участка: А – хвоя собрана в мае 2023 г.; Б – хвоя собрана в ноябре 2023 г.; □ – различия имеют тенденцию к статистически значимым по сравнению с контролем Рудинка 1, p<0,1, U-тест; * – различия статистически значимы по сравнению с контролем Рудинка 1, p<0,05, U-тест.

СО

0,004

0,002

Оценка различий активности исследуемых ферментов в разные сезоны года. Выявлены статистически значимые и имеющие тенденцию к статистически значимым отличия активности ферментов в разные сезоны в хвое сосен на участках Рудинка 1 (для SOD и APX), Рудинка 2 (для CAT и APX) и Масаны (для CAT и APX) (рис. 5). В хвое сосен, собранных на участках Гнездинка и Кулажин, зафиксированы различия (тенденция) в уровнях активности GPX в мае ноябре 2023 г.

и

Активность АРХ, МЕ/мл                          Активность SOD, МЕ/мл

Рис. 5. Активность антиоксидантных ферментов SOD (А), CAT (Б), APX (В), GPX (Г) в хвое, собранной в мае и ноябре 2023 г.; □ – различия имеют тенденцию к статистически значимым в хвое, собранной в мае и ноябре 2023 г., p<0,1, U-тест; * – различия активности фермента в хвое, собранной в мае и ноябре 2023 г., статистически значимы, p<0,05, U-тест.

0,014

0,012

0.01

0,008

0,006

На всех участках уровни активности SOD, CAT, APX, GPX в хвое, собранной в ноябре 2023 г., были выше значений в хвое, собранной в мае. Исключением являются активность SOD на участке Кулажин, активность CAT на участке Рудинка 1, активность APX на участке Гнездинка, активность GPX на участках Гнездинка и Кулажин.

Известно, что радиолиз воды является источником возникновения большого количества активных форм кислорода (АФК), что приводит к возникновению первичных радиационных повреждений. Чем ниже доза, тем большее влияние на ответ клетки оказывают генетические и эпигенетические механизмы, а также факторы окружающей среды [1, 8]. Прикреплённый образ жизни и накопление свободных радикалов в ходе фотосинтеза способствовали образованию у растений разветвлённой системы антиоксидантной защиты. Каждый субклеточный компартмент оснащён специализированным набором ферментативных и неферментативных антиоксидантов, которые при временных нарушениях взаимодействия между производством и переработкой АФК приводят к всплескам АФК, регулирующим последующие реакции, включая транскрипционные и метаболические изменения [9]. Повышение активности антиоксидантных ферментов, изменение содержания и окислительно-восстановительного статуса основных низкомолекулярных антиоксидантов являются неотъемлемой частью реакции растений на неблагоприятные условия окружающей среды [10]. В то же время действие низких доз облучения часто не вызывает аналогичный ответ [11].

При исследовании хронического низкодозового воздействия активность антиоксидантных ферментов может меняться различным образом, что показано в работе по оценке влияния хронического облучения на антиоксидантную систему топинамбура (Helianthus tuberosum L.) [12]. В нашем эксперименте показаны значимое и тенденция к значимому снижению активности ферментов SOD и GPX в хвое, собранной в ноябре 2023 г. на загрязнённых участках Гнездинка и Кулажин (рис. 1Б, 4Б). Отсутствие отличий на участке Масаны может быть связано с различием в составе дозообразующих радионуклидов [3]. Вместе с тем, не обнаружено устойчивого изменения активности антиоксидантных ферментов CAT и APX в хвое сосен Чернобыльской зоны отчуждения в ответ на хроническое облучение (рис. 2А, 2Б, 3А, 3Б). Не наблюдается изменений активности ферментов в хвое, собранной в мае 2023 г. (рис. 1А, 2А, 3А, 4А). Однако у всех исследуемых ферментов можно проследить схожую тенденцию к снижению активности на загрязнённых участках в ноябре. Это свидетельствует о снижении уровня окислительного стресса, вызванного сезонными изменениями факторов окружающей среды у данных популяций.

Низкие температуры значительно снижают скорость многих биохимических реакций, световая энергия, поглощённая в зимнее время, не может эффективно использоваться и способна повредить фотосинтетический аппарат. Явление, называемое «устойчивым тушением», обеспечивает фотозащиту и позволяет растениям выживать. Один из механизмов теплового и радиационного рассеивания избыточной энергии возбуждения фотосинтетического аппарата показан в работе [13]. Причём несколько защитных механизмов могут действовать параллельно. Увеличение активности антиоксидантных ферментов может быть результатом адаптации хвойных растений к сезонным колебаниям температуры. Действительно, в исследовании [14] показано, что активность аскорбатпероксидазы и глутатионредуктазы в хвое сосны белой (Pinus strobis L.) демонстрировала максимальные значения с ноября по апрель.

Техногенное воздействие может вызывать в природных популяциях неспецифичный ответ на смену времён года. В исследовании сезонных изменений активности пероксидазы (POD) и ка- талазы в побегах можжевельника (Juniperus sabina L.) в рекреационной, селитебной и промышленных зонах г. Йошкар-Ола активность CAT демонстрировала схожую динамику сезонных колебаний, однако самые большие значения активности и вариабельность были в рекреационной зоне, тогда как самые низкие – в промышленной, для POD наблюдали противоположную картину [15].

Влияние радиоактивного загрязнения на уровень антиоксидантных ферментов при смене сезонов в природных популяциях до этого не было исследовано. Наши результаты демонстрируют увеличение активности SOD и APX на контрольных участках и участке Масаны в ноябре, в то время как на участках Гнездинка и Кулажин значения активности близки к контрольным. Активности GPX на участках Рудинка 1, Рудинка 2 и Масаны не имели отличий между сезонами, а на участках Гнездинка и Кулажин обнаружена тенденция к снижению активности. Для фермента CAT не было выявлено закономерностей в изменении активности между сезонами.

Действие SOD заключается в катализе дисмутации O2^•-в кислород и пероксид водорода. Активация SOD при неблагоприятных воздействиях является ответом на увеличение продукции радикалов супероксида, что обеспечивает защиту клеток и тканей растений от окислительных повреждений. Однако при достижении определённого уровня окислительного стресса происходит снижение активности SOD [16]. Отсутствие ответа SOD на действие избыточной энергии фотосинтетического аппарата в популяциях сосны обыкновенной может свидетельствовать об истощении пула ферментов или модификации системы регуляции антиоксидантных ферментов на фоне действия ионизирующего излучения.

APX, CAT и GPX участвуют в разложении H2O2 в растениях. В хлоропластах супероксид и H2O2 образуются в больших количествах в результате высокоэнергетических реакций, происходящих в ходе фотосинтеза. На холоде происходит избыточное образование АФК вследствие затруднения реализации световой энергии [17]. Возможно, неоднозначность в изменениях активности CAT связана с тем, что в холодное время года замедление биохимических реакций негативно влияет на передачу сигнала в цитозоль для регуляции активности каталазы [18].

APX играет важную роль в разложении H2O2 непосредственно в хлоропластах [19]. Хроническое низкодозовое облучение не активирует APX на двух исследуемых участках на фоне сезонного изменения условий окружающей среды. GPX участвует в детоксикации H2O2 и органических гидропероксидов липидов и других активных молекул, а также может участвовать в регуляции клеточного окислительно-восстановительного гомеостаза и выполнять сигнальные функции [20]. Данный фермент не демонстрирует увеличения активности при низких температурах в контрольных участках и участке Масаны, но наблюдается снижение активности GPX на других загрязнённых участках. Снижение активности двух антиоксидантных ферментов, участвующих в понижении содержания пероксида водорода, на фоне отсутствия повышенной генерации фермента SOD может свидетельствовать об отсутствии окислительного стресса в популяциях сосны обыкновенной, проявляющегося у контрольных растений при похолодании. Тем не менее, требуются дополнительные исследования для обоснования выводов о влиянии хронического радиационного воздействия на состояние антиоксидантной системы сосны обыкновенной в разные сезоны года.

Заключение

Таким образом, впервые исследовано влияние хронического облучения на уровень антиоксидантных ферментов при смене сезонов в природных популяциях сосны обыкновенной. Показано значимое и тенденция к значимому снижению активности ферментов SOD и GPX в хвое, собранной в ноябре 2023 г. на загрязнённых участках Гнездинка и Кулажин, по сравнению с контрольным участком Рудинка 1. Не обнаружено устойчивого изменения активности антиоксидантных ферментов CAT и APX в хвое сосен Чернобыльской зоны отчуждения в ответ на хроническое облучение. У всех исследуемых ферментов можно проследить схожую тенденцию в снижении активности на загрязнённых участках в ноябре 2023 г. Снижение активности двух антиоксидантных ферментов, участвующих в утилизации пероксида водорода, на фоне отсутствия повышенной генерации фермента SOD в зимнее время может свидетельствовать об отсутствии окислительного стресса в популяциях сосны, проявляющегося у контрольных растений при похолодании.

При оценке различия уровней активности исследуемых ферментов в разные сезоны года обнаружено увеличение активности SOD и APX на контрольных участках и участке Масаны в ноябре, в то время как на участках Гнездинка и Кулажин значения активности близки к контрольным. Активности GPX на участках Рудинка 1, Рудинка 2 и Масаны не имели отличий между двумя исследуемыми сезонами, а на участках Гнездинка и Кулажин обнаружена тенденция к снижению активности. Для фермента CAT не было выявлено закономерностей в изменении активности между сезонами.

Статья подготовлена при поддержке гранта РНФ № 21-16-00004.