Оценка активности лизоцима после его ковалентной иммобилизации на наноалмазы детонационного синтеза

Введение. В последние годы многие исследователи отмечают перспективность применения наноалмазов детонационного синтеза в решении широкого спектра биомедицинских задач [1–3]. Одно из активно развиваемых направлений связано с изучением применимости данных наночастиц в качестве носителей при конструировании новых систем индикации для биомониторинга и медицинской диагностики (включая системы многократного действия) [4, 5] и систем адресной доставки биоактивных субстанций (например, лекарственных веществ) [6, 7]; при создании новых лечебных средств комбинированного и пролонгированного действия [8, 9]. Для использования в этих целях интерес представляют модифицированные наноалмазы (МНА), которые имеют высокоразвитую химически полиморфную, активную поверхность, обладают высокой коллоидной устойчивостью в различных дисперсионных средах и адаптированы для медико-биологических исследований [10–12].

Цель работы . Сравнительная оценка антибактериальной активности свободного и ковалентно иммобилизованного на МНА лизоцима с использованием в качестве модельной мишени грамотрицательных светящихся бактерий Photobacterium phosphoreum .

Объекты, методы и результаты исследований . В исследованиях использовали лизоцим из белка куриных яиц («Serva», Германия) и МНА марки RUDDM 0-125 (средний размер кластеров d 50 = 49,6 нм), производимые ООО «Реал-Дзержинск» (Дзержинск, Россия) по технологии [13], разработанной в ИБФ СО РАН (Красноярск, Россия). Для экспериментов готовили гидрозоль с концентрацией МНА 10,0 г/л добавлением деионизованной (ДИ) воды (Milli-Q system, «Millipore», США) к навеске порошка наночастиц.

Комплекс МНА-лизоцим получали ковалентной иммобилизацией фермента на поверхность наночастиц, функционализированную бензохиноном по известной методике [14, 15]. Предварительную активацию поверхности наночастиц бензохиноном и последующую пришивку лизоцима проводили таким же образом, как это изложено в наших предыдущих работах по конструированию на основе МНА и иных белков и ферментов систем адресной доставки биологически активных субстанций и биохимической диагностики физиологически важных веществ [5, 6]. Иммобилизацию фермента на носителе проводили при разных весовых соотношениях компонентов (лизоцим:МНА) – 1:1; 2:1; 4:1; 6:1; 8:1 (мг:мг). Наночастицы с иммобилизованным ферментом (комплекс МНА-лизоцим) собирали центрифугированием (Centrifuge 5415R, «Eppendorf», Германия) при 16000 g в течение 10 мин при 10°С. Полученный супернатант от- бирали для количественной оценки не иммобилизованного на МНА фермента, которую проводили спектрофотометрически в диапазоне 200– 400 нм (спектрофотометр UV-1800, «Shimadzu», Япония). Осадок трижды промывали раствором 0,25М NaCl для полного удаления остатков не связанного ковалентно (или неспецифически адсорбированного) частицами МНА лизоцима, каждый раз ресуспендируя наночастицы в свежей порции промывочного раствора, собирая их центрифугированием при указанных выше условиях и отбирая супернатанты для спектрального анализа. Расчеты количества ковалентно пришитого на МНА лизоцима проводили из величин оптической плотности исходного раствора фермента и супернатантов при длине волны 279 нм.

При сравнительной оценке активности свободного и иммобилизованного на МНА лизоцима модельной мишенью являлись грамотрица-тельные светящиеся морские бактерии Photobacterium phosphoreum – штамм 2015 из Коллекции культур микроорганизмов IBSO, ИБФ СО РАН, Красноярск collection). Для экспериментов использовали бактериальные клетки, которые получали при культивировании данного штамма в жидкой питательной среде по известной технологии /collection/). Бактериальные клетки дважды отмывали от питательной среды физраствором, после чего ресуспендировали в ДИ воде и использовали в исследованиях. Для работы готовили клеточные суспензии с величиной оптической плотности от 0,3 до 0,6 оптических единиц при длине волны 600 нм.

Функциональную активность лизоцима оценивали по изменению величины оптической плотности бактериальной суспензии после добавления аликвоты раствора фермента или гидрозоля комплекса МНА–лизоцим. Выбор этого критерия оценки основывался на общеизвестном механизме действия изучаемого фермента – разрушение пептидогликанового слоя клеточной стенки бактерий, что сопровождается их деструкцией и, как следствие, снижением величины оптической плотности бактериальной суспензии. Контрольные (без добавления препаратов лизоцима) и опытные (с добавлением препаратов фермента) суспензии бактериальных клеток инкубировали при комнатной температуре и постоянном перемешивании со скоростью

250 об/мин (Orbital Shaker OS-10, «BIOSAN», Латвия). Через равные промежутки времени из суспензий отбирали образцы объемом 1 мл и оценивали величину их оптической плотности при длине волны 600 нм (спектрофотометр UV-1800).

В предварительных исследованиях с использованием растворов лизоцима было показано (рис. 1), что в экспериментальных условиях наибольший лизис бактериальных клеток наблюдался через 1 час инкубации. Максимальный эффект достигался при концентрации фермента в клеточной суспензии 25 мкг/мл, в этом случае регистрировалось снижение оптической плотности на 60–65 %. Как видно из представленных данных (рис. 1), двукратное повышение концентрации фермента не приводило к увеличению лизиса бактерий P. phosphoreum при исследованных временах инкубации клеточных суспензий.

Установлено (рис. 2), что при ковалентной иммобилизации лизоцима сорбционная емкость МНА существенным образом зависит от весового соотношения компонентов – фермент:наночастицы. Из приведенных данных видно, что в одинаковых экспериментальных условиях максимальная пришивка фермента на МНА (до 1 мг белка на 1 мг наночастиц) достигается при их весовом соотношении 6:1, которое, по-видимому, является оптимальным. Увеличение количества белка в реакционной смеси (соотношение лизоцима и МНА – 8:1) не приводит к повышению показателя сорбционной емкости наночастиц (рис. 2). Следует отметить, что максимальная сорбционная емкость МНА, установленная в данной работе при ковалентной пришивке лизоцима, существенно (в 4–5 раз) превышает аналогичный показатель, полученный нами ранее [16] при использовании весового соотношения фермент:наночастицы – 1:2. Вероятно, не менее важным фактором, влияющим на эффективность ковалентной пришивки белка, может являться и размер кластеров используемых наночастиц. В пользу такого предположения свидетельствует то, что в упомянутой выше работе [16] для пришивки лизоцима нами были использованы МНА со значительно большим средним размером кластеров (d 50 = 100 нм) по сравнению с наночастицами, использованными в настоящей работе.

Время, минуты

Рис. 1. Оптическая плотность клеточных суспензий Photobacterium phosphoreum с добавлением разных концентраций лизоцима в зависимости от времени инкубации.

Данные в сериях нормированы на величины начальной оптической плотности образцов сразу после добавления фермента

Представленные выше результаты свидетельствуют, что соотношение наноноситель: белок и размерный фактор наночастиц могут иметь принципиальное значение для эффективной ковалентной иммобилизации фермента (ферментов).

Как показали эксперименты (рис. 3), ковалентно иммобилизованный на МНА лизоцим проявляет антибактериальную активность и вызывает лизис бактериальных клеток P. phosphoreum. Это подтверждается снижением оптической плотности клеточной суспензии (на 20-25%) при ее инкубации в течение 3 часов в присутствии комплекса МНА–лизоцим. Следует отметить, что при проведении этих исследований финальная концентрация вносимого в суспензию фермента, иммобилизованного на МНА, составляла 25 мкг/мл. Как было показано выше (см. рис. 1), при такой концентрации свободного лизоцима наблюдался наибольший эффект лизиса бактерий. Бактериолитический эффект комплекса МНА–лизоцим не опосредован воздействием наночастиц на клетки. В модельных экспериментах мы не выявили различий в изменениях оптической плотности контрольных (без добавления МНА) и опытных (при добавлении МНА) бактериальных суспензий при их инкубации в течение 3 часов. При этом концентрация наночастиц в клеточной суспензии была такой же, как и в случае добавления к суспензии комплекса МНА-лизоцим. С целью проверки усиления бактериолитической эффективности иммобилизованного на МНА фермента в суспензию бактериальных клеток P. phosphoreum предварительно добавляли ЭДТА до финальной концентрации 2 мМ. Известно [17], что такая обработка увеличивает доступ к пептидогликановому слою клеточной стенки грамотрицательных бактерий и, как следствие, повышает их чувствительность к воздействию лизоцима. В результате проведенных исследований было показано (рис. 3), что добавка ЭДТА увеличивает лизирующий эффект комплекса МНА–лизоцим более чем в 2 раза. При этом следует отметить, что активность иммобилизованного лизоцима была, тем не менее, ниже по сравнению с активностью свободного фермента. Из сравнительного анализа данных следует (рис. 1, 3), что при одинаковой концентрации (25 мкг/мл) фермента в клеточной суспензии эффективность действия свободного лизоцима примерно в 3 раза выше по сравнению с лизоцимом, находящимся в составе комплекса. В случае использования свободного фермента снижение оптической плотности суспензии на 60–65 % наблюдается при ее инкубации в течение 1 часа. При использовании комплекса МНА-лизоцим на фоне предварительной добавки ЭДТА в бактериальную суспензию аналогичный показатель достигается при инкубации суспензии в течение 3 часов.

Соотношение лизоцим : МНА (мг : мг)

Рис. 2. Сорбционная емкость МНА при ковалентной иммобилизации лизоцима в зависимости от количества фермента в реакции

Наблюдаемое снижение активности ковалентно пришитого на МНА лизоцима по сравнению со свободным ферментом может быть вызвано следующими причинами. Из-за неправильной пространственной ориентации комплексов МНА–лизоцим по отношению к бактеральным клеткам часть молекул активного фермента не взаимодействует с клеточной стенкой. При ковалентной иммобилизации лизоцима на наночастицах экранируется активный центр части молекул фермента, в результате чего они не могут выполнять каталитическую функцию. Нельзя исключить, что в процессе ковалентной пришивки часть молекул лизоцима может одновременно взаимодействовать с несколькими кластерами МНА. Образование таких сложных агрегатов наночастиц и молекул фермента может приводить к снижению (или потере) каталитической функции лизоцима. Выяснение этих вопросов требует дальнейшего изучения.

Рис. 3. Оптическая плотность клеточных суспензий Photobacterium phosphoreum в присутствии комплекса МНА–лизоцим в зависимости от времени инкубации. Данные в сериях нормированы на величину начальной оптической плотности образцов сразу после добавления комплекса МНА–фермент

Выводы. Таким образом, в работе показано, что     иммобилизованный     посредством ковалентной пришивки на частицы МНА лизоцим проявляет функциональную активность и вызывает лизис бактериальных клеток. Это продемонстрировано на примере использования в качестве модельной мишени грамотрица-тельных светящихся бактерий Photobacterium phosphoreum. В экспериментах показано, что эффективность ковалентной иммобилизации лизоцима в значительной степени определяется соотношением компонентов – фермент: МНА. Высказано предположение, что еще одним важным фактором, оказывающим влияние на эффективность ковалентной пришивки белка, может являться размер кластеров наночастиц. Установлено, что при соотношении   бе- лок:наночастицы – 6:1 на 1 мг МНА со средним размером кластеров d50 = 49,6 нм может быть ковалентно иммобилизовано до 1 мг лизоцима. В сравнительных экспериментах показано, что функциональная    активность    фермента, входящего в состав комплекса МНА–лизоцим, снижена по сравнению с активностью свободного фермента. Предполагается, что приоритетной задачей дальнейших исследований будет являться определение и оптимизация условий повышения функциональной активности лизоцима при его ковалентной пришивке на МНА для      повышения      антибактериальной эффективности комплекса наночастицы– фермент.

Исследования выполнены при частичной финансовой поддержке за счет средств государственного задания на проведение фундаментальных исследований РАН (проект № 0360-2014-0006).